索明環(huán)， 溫冬梅， 張秀明， 周甲思， 陳亞瓊， 吳劍楊， 徐全中， 胡 婷， 闞麗娟

(中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)中心，廣東中山528403)

糖化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)是糖尿病診斷和并發(fā)癥控制的金標(biāo)準(zhǔn)。2010年美國糖尿病協(xié)會(American Diabetes Association，ADA)將HbA1c列為糖尿病診斷的標(biāo)準(zhǔn)［1］。HbA1c降低可以減少大血管及微血管病變，并且濃度的變化與患者的預(yù)后息息相關(guān)［2-3］。保證HbA1c檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性對臨床診斷和監(jiān)測糖尿病至關(guān)重要。在我國，某些醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室還沒有開展這一項(xiàng)目的檢測，且HbA1c的檢測方法眾多，標(biāo)準(zhǔn)化工作剛剛開展［4］。若要推廣HbA1c的檢測，保證標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃順利實(shí)施就必須先了解樣本儲存及運(yùn)送的條件，避免因?yàn)榉治銮耙蛩貙?dǎo)致結(jié)果的不可比。我們選用了目前醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的3種HbA1c檢測系統(tǒng)，通過對樣本不同存放溫度及時(shí)間的限制，了解樣本的儲存條件及穩(wěn)定性，為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)范開展HbA1c檢測和標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃及科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

材料和方法

一、檢測系統(tǒng)

1.陽離子離子交換高效液相色譜法(HPLC)

采用Bio-Rad variantⅡTurbo糖化血紅蛋白檢測儀(簡稱Bio-Rad variantⅡTurbo)。應(yīng)用配套的試劑、校準(zhǔn)品、防護(hù)柱、分析柱及質(zhì)控品。按廠家要求400個(gè)測試更換防護(hù)柱，2 000個(gè)測試更換分析柱，更換柱子后按要求進(jìn)行活化定標(biāo)。

2.親和層析HPLC 采用Primus Ultra2糖化血紅蛋白檢測儀(簡稱Primus Ultra2)及配套試劑、分析柱。校準(zhǔn)品及質(zhì)控品為Bio-Rad公司產(chǎn)品。按要求反轉(zhuǎn)更換柱子，定期做酶清洗。

3.免疫抑制比濁法 應(yīng)用Roche Modular PPI全自動生化分析儀(簡稱Roche Modular PPI)及配套HbA1c測定試劑、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品。

二、穩(wěn)定性評價(jià)

根據(jù)美國糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃(National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP)儲存校準(zhǔn)品及質(zhì)控品的穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行全血樣本的穩(wěn)定性評價(jià)。NGSP規(guī)定:HbA1c測定結(jié)果以－70℃或更低溫度±3s為可接受范圍，在±3s范圍內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定，否則為不穩(wěn)定［5］。

三、樣本的制備

1.選取當(dāng)日用Bio-Rad variantⅡTurbo檢測系統(tǒng)檢測的分布范圍為6.0%～7.0%、9.0%～10.0%及11.0%～12.0%的乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血樣本各5支，觀察每支樣本的檢測結(jié)果分析圖譜，摒棄存在異常圖譜的樣本。

2.檢測選取的全血樣本的平均紅細(xì)胞體積和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度，同時(shí)用法國Sebia Capillary 2毛細(xì)管電泳儀檢測，排除地中海貧血和異常血紅蛋白樣本。

3.最終選定3支樣本，本實(shí)驗(yàn)室 Bio-Rad variantⅡTurbo檢測結(jié)果分別為6.2%(樣本1)、9.3%(樣本 2)、11.1%(樣本 3)。收集同一患者同一時(shí)間抽取的EDTA-K2抗凝血，混合后分裝，每管50μL。分別置于常溫(20～25℃)、4℃、－30 ℃、－70 ℃保存，分別于第 1、3、5、7、14、21、28、35、42、56、84 天用 3 種檢測系統(tǒng)檢測，同一樣本同一時(shí)間每個(gè)檢測系統(tǒng)各檢測2次，取平均值作為評價(jià)結(jié)果。

結(jié) 果

一、－70℃保存條件下樣本的測定結(jié)果

－70℃保存條件下3種檢測系統(tǒng)的結(jié)果顯示出很好的穩(wěn)定性。其中Bio-Rad variantⅡTurbo測定樣本的變異系數(shù)(CV)為2.12%～2.80%;Primus Ultra2的 CV為2.19%～2.71%;Roche Modular PPI的 CV為2.28%～2.91%。Bio-Rad variantⅡTurbo樣本1結(jié)果的穩(wěn)定性范圍為5.97%～7.00%、樣本 2為8.78%～9.98%、樣本3為10.48%～12.41%。Primus Ultra2樣本1結(jié)果的穩(wěn)定性范圍為6.06%～7.14%、樣本2為8.81%～10.41%、樣本 3為10.50%～11.97%。Roche Modular PPI樣本1結(jié)果的穩(wěn)定性范圍為5.96%～7.10%、樣本 2為8.88%～10.20%，樣本3為10.86%～12.45%。見圖1、表1。

圖1 －70℃保存樣本的穩(wěn)定性

二、不同存放溫度、不同時(shí)間、不同濃度、不同儀器樣本的穩(wěn)定性結(jié)果的判斷

以表1所列的穩(wěn)定性范圍作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)結(jié)果超出穩(wěn)定性范圍時(shí)，則穩(wěn)定時(shí)間以上一次存儲時(shí)間為準(zhǔn)。當(dāng)3個(gè)樣本全部滿足穩(wěn)定性范圍時(shí)，則判定該儲存條件可保持樣本穩(wěn)定。3種檢測系統(tǒng)檢測樣本的穩(wěn)定性見表2和圖2。

表1 －70℃保存樣本3種檢測系統(tǒng)測定結(jié)果的分析與比較 (%)

表2 3種檢測系統(tǒng)HbA1c樣本在不同條件下的穩(wěn)定性

圖2 3種檢測系統(tǒng)不同條件下樣本的穩(wěn)定性

1.Bio-Rad variantⅡTurbo 樣本1常溫條件下可穩(wěn)定7 d、4℃可穩(wěn)定14 d、－30℃可穩(wěn)定35 d;樣本2常溫可穩(wěn)定21 d、4℃可穩(wěn)定28 d、－30℃可穩(wěn)定35 d;樣本3常溫可穩(wěn)定7 d、4℃可穩(wěn)定14 d、－30℃可穩(wěn)定42 d。因此，用Bio-Rad variantⅡTurbo測定樣本常溫可穩(wěn)定 7 d、4℃可穩(wěn)定14 d、－30℃可穩(wěn)定35 d。

2.Primus Ultra2樣本1常溫條件下可穩(wěn)定14 d、4及－30℃均可穩(wěn)定84 d;樣本2常溫可穩(wěn)定21 d、4℃可穩(wěn)定56 d、－30℃可穩(wěn)定84 d;樣本3常溫可穩(wěn)定14 d、4℃可穩(wěn)定56 d，－30℃可穩(wěn)定84 d。因此，用Primus Ultra2測定樣本常溫可穩(wěn)定14 d、4℃可穩(wěn)定56 d、－30℃可穩(wěn)定84 d。

3.Roche Modular PPI 樣本1常溫條件下可穩(wěn)定14 d、4及－30℃均可穩(wěn)定84 d;樣本2常溫可穩(wěn)定21 d、4及－30℃均可穩(wěn)定84 d;樣本3常溫可穩(wěn)定14 d，4及－30℃均可穩(wěn)定84 d。因此，用Roche Modular PPI測定樣本常溫可穩(wěn)定14 d、4及－30℃均可穩(wěn)定84 d。

討 論

HbA1c可反映機(jī)體2～3個(gè)月的血糖水平，不受患者當(dāng)天抽血狀態(tài)的影響，是評價(jià)糖尿病患者血糖控制狀況極有價(jià)值的指標(biāo)。美國ADA已經(jīng)將其列為診斷糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)。而國內(nèi)還沒有將HbA1c作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要原因是國內(nèi)檢測HbA1c的方法眾多，結(jié)果差異性較大。這2年國內(nèi)加快了HbA1c的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。相信不久的將來，HbA1c也會成為中國糖尿病診斷的標(biāo)準(zhǔn)。但要保證HbA1c檢測的正確性，就要對實(shí)驗(yàn)方法和檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性非常了解，本研究選用了3個(gè)常見的檢測系統(tǒng)進(jìn)行評價(jià)。

本研究選用的穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)是用－70℃測定結(jié)果的均值的95%可信區(qū)間來判斷。因?yàn)楹芏鄬W(xué)者已經(jīng)證明－70℃下存放的樣本用離子交換HPLC測定至少1年是穩(wěn)定的［6］，并且－70℃保存樣本也是DCCT參考實(shí)驗(yàn)室和NGSP網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室采用的保存質(zhì)控品和校準(zhǔn)品的條件［7-8］。故采用此穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)可靠、可行。

本研究中評價(jià)了3種不同方法、不同儀器、不同濃度樣本、不同存放條件對檢測結(jié)果的干擾，結(jié)果確實(shí)存在差異。Bio-Rad variantⅡTurbo測定樣本常溫可穩(wěn)定7 d，4℃可穩(wěn)定14 d，－30℃可穩(wěn)定 35 d;而 Little等［8］的結(jié)果顯示 Bio-Rad VariantⅡ?yàn)槌? d、4℃ 57 d、－20℃ 28 d;并且王冬環(huán)等［9］檢測結(jié)果也顯示東曹G7測定的穩(wěn)定性為－20℃ 14 d、4℃ 63 d。這3臺儀器均采用離子交換HPLC，4℃穩(wěn)定性相差較大，這也可能與儀器性能有關(guān)。因?yàn)锽io-Rad variantⅡTurbo檢測樣本的速度與其他儀器比較提高了許多，但在一定程度上也犧牲了HPLC檢測的穩(wěn)定性;Primus Ultra2及Roche Modular PPI則顯示出了較好的穩(wěn)定性，與Little等［8］的檢測結(jié)果［Primus CLC(385 and 330)顯示全血穩(wěn)定性為常溫14 d、4及－20℃ 57 d］一致。但在本研究中2種檢測系統(tǒng)顯示出了更好的穩(wěn)定性，其中Primus Ultra24℃可穩(wěn)定56 d、－30℃至少可穩(wěn)定84 d，Roche Modular PPI 4及－30℃均至少可穩(wěn)定84 d。這可能與不同的檢測系統(tǒng)及檢測方法有關(guān)。親和層析HPLC是以糖基化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特異性為測定原理。HbA1c可以與親和樹脂連接，而非糖化血紅蛋白不可以，因而被分離。親和層析HPLC不受溫度、氨基甲酰糖化血紅蛋白和胎兒血紅蛋白的干擾，結(jié)果可靠。免疫抑制比濁法是依據(jù)血紅蛋白上糖化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而設(shè)計(jì)，原理是根據(jù)HbA1c與相應(yīng)的單抗結(jié)合發(fā)生凝集反應(yīng)的特性，受干擾因素也較小。因此，這2種檢測系統(tǒng)顯示出比較好的穩(wěn)定性。

綜上所述，不同的檢測系統(tǒng)在不同的樣本存放條件下，檢測結(jié)果存在差異。實(shí)驗(yàn)室無論檢測常規(guī)患者樣本還是做實(shí)驗(yàn)研究，或?qū)嶒?yàn)標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃都應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求及檢測系統(tǒng)做好樣本的儲存工作。

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