王飛 王妍 程律莎 謝木源 張麗君? 梁世中??

(1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳518055;3.廣東藥學(xué)院 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

疾病或創(chuàng)傷造成的骨缺損在臨床上十分常見，近年來，利用組織工程骨修復(fù)骨缺損的研究方興未艾［1-5］.聚乳酸-羥基乙酸/磷酸三鈣(Polylactic Glycolic Acid/Tricalcium Phosphate，PLGA/TCP)材料適應(yīng)快速成型制造，具有優(yōu)良的力學(xué)性能和化學(xué)穩(wěn)定性，其在生物體內(nèi)的降解產(chǎn)物乳酸可參與到新陳代謝中，最終生成二氧化碳和水排出體外，且其多孔的結(jié)構(gòu)可提供很大的表面積/體積比，適合應(yīng)用于骨組織工程［6-7］.

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Marrow Mesenchymal Stem Cells，hMSCs)由于獲取途徑較為便捷，擴(kuò)增表型穩(wěn)定，同時(shí)避免了醫(yī)學(xué)倫理爭議，因而成為理想的組織工程骨種子細(xì)胞，用于向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)以構(gòu)建組織工程骨.Tali 等［8］采用hMSCs 構(gòu)建軟骨，體外接種生物活性材料并植入裸鼠體內(nèi)，成軟骨效果理想.黃永輝等［9］采用hMSCs 和納米晶膠原骨構(gòu)建組織工程骨，體外培養(yǎng)后成骨現(xiàn)象良好.Kim 等［10］構(gòu)建了hMSCs 和預(yù)先礦化的絲支架結(jié)合的組織工程骨并進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示hMSCs在絲支架上增殖和成骨分化的效果明顯.

文中著重研究hMSCs 的成骨定向分化能力及與PLGA/TCP 的生物相容性，為后續(xù)利用hMSCs 和PLGA/TCP 構(gòu)建組織工程骨以應(yīng)用于動物試驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

第5 代的hMSCs 細(xì)胞株購自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司.在37 ℃下于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的胰蛋白酶消化傳代，于每4 天換液，每7 天傳代，至第8 代用于實(shí)驗(yàn).

1.1.2 主要試劑及儀器

主要試劑如下:低糖DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酸和雙抗均購自Gibco 公司，抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松均購自Sigma 公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，VON KASSA 染色試劑盒、核固紅復(fù)染試劑盒和堿性磷酸酶(ALP)酶活性檢測試劑盒均購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司.

主要儀器如下:Hera Cell 240 型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國熱電公司生產(chǎn);Olympus CKX41 型倒置相差顯微成像系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司生產(chǎn);蘇凈安泰BHC-1000ⅡA2 型生物安全柜，江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司生產(chǎn);Eppendorf 5810 R 型臺式離心機(jī)，德國艾本德公司生產(chǎn);Spectramax M5e 型多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司生產(chǎn);Quanta 450 型掃描電鏡，美國FEI 公司生產(chǎn).

1.1.3 hMSCs 的完全和成骨分化培養(yǎng)基

hMSCs 的完全培養(yǎng)基包括如下成分:低糖DMEM 88%，胎牛血清10%，L-谷氨酸1%，青/鏈霉素1%.以上成分含量均為體積分?jǐn)?shù).

hMSCs 的成骨分化培養(yǎng)基包括如下成分:高糖DMEM 86.5%，胎牛血清10%，L-谷氨酸1%，青/鏈霉素1%，10 mmol/L 抗壞血酸0.5%，1 mol/L β-甘油磷酸鈉1%，1mmol/L 地塞米松0.01%.以上成分含量均為體積分?jǐn)?shù).

1.1.4 PLGA/TCP 的預(yù)處理

PLGA/TCP 由清華大學(xué)機(jī)械工程系提供，材料通過Ⅰ型膠原進(jìn)行處理以利于細(xì)胞的附著生長.在無菌環(huán)境下將材料切割成4 mm ×4 mm ×2 mm 的小塊.提前準(zhǔn)備好滅菌的平皿，將切割好的材料放入平皿中，紫外線照射30 min;然后將材料轉(zhuǎn)入滅菌的燒杯，用75%酒精完全浸沒材料，浸泡30 min 滅菌并提高材料的親水性.吸出酒精，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3 次后浸泡過夜，以盡可能除去殘存的乙醇.

接種細(xì)胞前將材料在培養(yǎng)基中浸泡24 h，取出后以無菌濾紙吸干水分.

1.2 實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)方法

1.2.1 hMSCs 在平面上的接種和換液

取對數(shù)生長期的第8 代hMSCs，以完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×105個(gè)/mL.6 孔板每孔接種200 μL 細(xì)胞懸液，補(bǔ)充培養(yǎng)基至3 mL.細(xì)胞分為對照組和成骨組，4 天時(shí)用完全培養(yǎng)基和成骨分化培養(yǎng)基對應(yīng)換液，之后每3 天換液.

1.2.2 hMSCs 在平面上成骨分化的VON KASSA染色檢測

hMSCs 接種于6 孔板21 天后，小心抽去孔里的培養(yǎng)基，加入清理液清洗，用固定液固定10 min 后清洗2 次，染色1 h，再用清理液孵育2 min，平衡液孵育5 min，繼續(xù)用清理液孵育2 min，核固紅復(fù)染后于倒置顯微鏡下觀察拍照，每組3 個(gè)復(fù)孔.

1.2.3 hMSCs 在平面上成骨分化的ALP 酶活性檢測

hMSCs 接種于6 孔板后的第3、6、9、12、15、18和21 天，分別取一塊6 孔板，吸盡液體，用清理液沖洗和0.25%胰蛋白酶消化，用吸管輕輕吹打數(shù)次，再加入含血清培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞，加入300 μL 裂解液，4 ℃下孵育30 min，13000 r/min 下離心5 min，移取上清，進(jìn)行蛋白定量檢測后，取5 μL上清加入220 μL 緩沖液和25 μL ALP 反應(yīng)液，在酶聯(lián)免疫檢測儀上以405 nm 波長測定各孔0 和5 min的光密度(OD)值，每組3 個(gè)復(fù)孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.2.4 hMSCs 在PLGA/TCP 上的接種和換液

取對數(shù)生長期的第8 代hMSCs，以完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×104個(gè)/mL.

將經(jīng)過預(yù)處理的PLGA/TCP 置于96 孔板中，用1 mL 的注射器取100 μL 細(xì)胞懸液逐滴地滴加到材料表面并下滲，3 min 后將材料翻轉(zhuǎn)，以同樣的方式滴加到另一面，靜置15 min 后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 天換液，進(jìn)行成骨分化的材料/細(xì)胞復(fù)合物在接種后4 天用成骨分化培養(yǎng)基換液.

1.2.5 hMSCs 在PLGA/TCP 上增殖和成骨分化的電鏡檢測

hMSCs 接種于PLGA/TCP 1、3、5、7 天后，分別取1 塊材料，用PBS 清洗以去除未貼壁的細(xì)胞，再經(jīng)3%戊二醛固定，乙醇系列脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，用掃描電鏡觀察hMSCs 在PLGA/TCP 上的黏附增殖情況.

材料/細(xì)胞復(fù)合物用成骨分化培養(yǎng)基換液7 天后，取1 塊材料，用掃描電鏡觀察hMSCs 在PLGA/TCP 上的成骨分化情況.

1.2.6 hMSCs 在PLGA/TCP 上增殖的MTT 檢測

hMSCs 接種于PLGA/TCP 1、3、5、7 天后，分別取一塊96 孔板，每孔加入5 g/L 的MTT 溶液10 μL，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，每孔再加入100 μL 的Formanzan 溶解液，在培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育4h，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formanzan 全部溶解.在酶聯(lián)免疫檢測儀上以570nm 波長測定各孔的OD 值，每組6 個(gè)復(fù)孔，以hMSCs 直接接種于孔板底部作為對照，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次.

1.2.7 hMSCs 在PLGA/TCP 上成骨分化的ALP 酶活性檢測

材料/細(xì)胞復(fù)合物用成骨分化培養(yǎng)基換液1、3、5、7 天后，分別取一塊96 孔板，吸盡液體，用清理液沖洗和0.25%胰蛋白酶消化，并用吸管輕輕吹打數(shù)次，再加入含血清培養(yǎng)液終止消化，離心收集細(xì)胞，加入100 μL 裂解液，4 ℃下孵育30 min，13000 r/min 下離心5 min，移取上清，進(jìn)行蛋白定量檢測后，取5 μL上清加入220 μL 緩沖液和25 μL ALP 反應(yīng)液，每組6個(gè)復(fù)孔，以hMSCs 直接接種于孔板底部作為對照，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次.

1.2.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，進(jìn)行t 檢驗(yàn)，若P ＜0.05 則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 hMSCs 的成骨定向分化結(jié)果

2.1.1 hMSCs 在平面上成骨分化的VON KASSA染色結(jié)果

VON KASSA 染色結(jié)果(見圖1)顯示:對照組細(xì)胞增殖呈長梭形成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞排列密集，呈漩渦狀，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的重疊及鈣結(jié)節(jié)的形成;成骨組細(xì)胞逐漸集中，呈鋪路石狀，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，局部細(xì)胞呈重疊生長，逐漸堆積，礦鹽沉積，形成多個(gè)黑色的鈣結(jié)節(jié).

圖1 6 孔板上hMSCs 成骨分化的VON KASSA 染色結(jié)果Fig.1 VON KASSA photos of osteogenic differentiation of hMSCs on 6-well plate

2.1.2 成骨分化標(biāo)志物的ALP 酶活性檢測結(jié)果

ALP 酶活性是細(xì)胞成骨分化水平的重要標(biāo)志，ALP 酶活性檢測結(jié)果(見圖2)顯示:成骨組在換用成骨分化培養(yǎng)基后3 天已與對照組有顯著性差異(P ＜0.01);分化初期ALP 酶活性隨時(shí)間不斷增高，12 天后達(dá)到最高值，15 天后略有下降，之后進(jìn)入一個(gè)平臺期;對照組細(xì)胞隨時(shí)間延長其ALP 酶活性也略有上升，但增幅明顯小于成骨組.

圖2 hMSCs 在6 孔板上成骨分化的ALP 酶活性檢測Fig.2 ALP test results of osteogenic differentiation of hMSCs on 6-well plate

2.2 hMSCs 與PLGA/TCP 的相容性結(jié)果

2.2.1 hMSCs 在PLGA/TCP 上增殖的檢測結(jié)果

電鏡下觀察到:未接種細(xì)胞的空白材料其多孔結(jié)構(gòu)非常明顯，孔與孔之間結(jié)構(gòu)致密，見圖3(a);接種(增殖)后1 天，細(xì)胞呈梭形附著在材料上，見圖3(b);接種后3 天，細(xì)胞表面生長大量微絨毛，表明細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞間彼此相連，見圖3(c);接種后5 天，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞外基質(zhì)開始形成薄層均勻分布在材料上，基質(zhì)層上可見小球狀顆粒，見圖3(d);接種后7 天，細(xì)胞已長入支架孔中，細(xì)胞間有大量微絲相連，見圖3(e).

圖3 hMSCs 在PLGA/TCP 上增殖的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM photos of hMSCs proliferation on PLGA/TCP

MTT 檢測結(jié)果(見表1)顯示:與平面培養(yǎng)相對照，hMSCs 在PLGA/TCP 上的增殖速度較快，增殖效果更為明顯.增殖1 和3 天，材料上hMSCs 和平面對照組的增殖速度較為接近，兩者的OD 值沒有顯著性差異(P＞0.05);增殖5 和7 天，材料上hMSCs的增殖速度明顯高于平面對照組，兩者的OD 值有顯著性差異(P ＜0.01).分析認(rèn)為，平面對照hMSCs在3～5 天之間處于對數(shù)生長期，隨后在7 d 進(jìn)入生長相對緩慢的平臺期，而在材料上生長的hMSCs 在7 d 仍然具有較高的增殖速度，究其原因，應(yīng)與PLGA/TCP的多孔結(jié)構(gòu)具有很大的表面積/體積比，使得細(xì)胞有更多的空間可以粘附和生長有關(guān).

表1 hMSCs 在PLGA/TCP 材料上增殖的MTT 檢測結(jié)果1)Table 1 MTT test results of hMSCs proliferati on on PLGA/TCP

2.2.2 hMSCs 在PLGA/TCP 上的成骨分化效果

掃描電鏡下觀察到，用成骨分化培養(yǎng)基換液7天后，細(xì)胞基質(zhì)層已覆蓋材料表面積的60%以上，隱約可見鈣結(jié)節(jié)，見圖4.

ALP 酶活性檢測結(jié)果顯示，在PLGA/TCP 上成骨分化的hMSCs，其ALP 酶活性要高于平面對照組，這意味著材料能促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化.分化第1 天，材料和平面對照組的ALP 酶活性較為接近，兩者沒有顯著性差異(P＞0.05);分化第3 天，材料上hMSCs 的ALP 酶活性已高于平面對照組，兩者有顯著性差異(P ＜0.05)，到第5 和第7 天，兩者差異更為顯著(P ＜0.01)，見圖5.

圖4 hMSCs 在PLGA/TCP 上成骨分化7d 的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4 SEM photo of osteogenic differentiation of hMSCs on PLGA/TCP for 7 days

圖5 hMSCs 在材料和平面對照上的成骨分化趨勢比較Fig.5 Comparison of osteogenic differentiation between hMSCson PLGA/TCP and the control

3 結(jié)語

目前，骨組織工程的研究主要集中在以下4 個(gè)方面:種子細(xì)胞，支架材料，骨生長因子和臨床應(yīng)用［11-12］.文中從支架材料和種子細(xì)胞兩個(gè)方面著手，重點(diǎn)考察了hMSCs 作為種子細(xì)胞與PLGA/TCP結(jié)合的生物相容性.

文中研究表明，hMSCs 作為種子細(xì)胞具有很強(qiáng)的成骨分化能力，接種于平面上的hMSCs 在成骨分化21 天時(shí)已經(jīng)具有典型的骨細(xì)胞形態(tài)，鈣結(jié)節(jié)明顯，ALP 酶活性則明顯高于空白對照組，前12 天大幅上升，隨后逐漸進(jìn)入平臺期.

接種于PLGA/TCP 上的hMSCs 展現(xiàn)了與材料良好的生物相容性.電鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞充分利用了材料的多孔特性，在材料上的增殖和分化有別于平面對照組，且其增殖能力明顯好于平面對照組.MTT 檢測顯示，在接種初期，兩者比較接近，5 天后平面對照組的細(xì)胞受到接觸抑制而轉(zhuǎn)入生長緩慢的平臺期，而材料上生長的細(xì)胞仍具有較高的增殖速度，這表明PLGA/TCP 較大的表面積/體積比能支持更多的細(xì)胞生長.同樣，在PLGA/TCP 上進(jìn)行成骨分化的細(xì)胞，其分化效果也高于平面對照組，ALP 酶活性檢測顯示，分化初期兩者具有相同的ALP 酶活性，3 天時(shí)立體培養(yǎng)組的ALP 酶活性逐漸超越對照組，5 天時(shí)開始有更顯著的差異.

通過驗(yàn)證PLGA/TCP 與種子細(xì)胞hMSCs 的良好的生物相容性，文中研究為兩者結(jié)合生成組織工程骨并進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ).

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