越南安息香種子脂肪酸的在線甲基化-GC分析研究

傅宇飛，孫 楊，潘再法，王麗麗

(浙江工業(yè)大學 化學工程與材料學院，浙江 杭州 310014)

越南安息香(Styraxtonkinesis)，又名白花樹，東京野茉莉。屬安息香科安息香屬喬木樹種，主要分布于熱帶、亞熱帶海拔100～2 700 m的低山丘陵區(qū)。其藥用部分為安息香樹脂[1]，其果實產(chǎn)量和產(chǎn)油率高，單株年產(chǎn)果實可達40 kg，可作為發(fā)展生物柴油專用油料樹種[2]，其種子含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)如脂肪油酯、礦物質(zhì)元素，維生素等[3]。越南安息香種子能否成為一種新型食用油資源引起廣泛關(guān)注。有文獻報道采用索式提取和衍生化等前處理方法，繼而進行氣相色譜法測定果實中的脂肪酸[4]，但該方法前處理過程繁瑣費時，使用大量有機溶劑和較大量的樣品, 因此需要開發(fā)一種快速、簡便、準確的分析方法。在線甲基化-氣相色譜法(on-line methylation-gas chromatography) 是近年來迅速發(fā)展的一種快速分析有機酸、酯類等物質(zhì)的方法[5]。采用該法并以稀釋的四甲基氫氧化銨(TMAH)為衍生化試劑測定植物油和動物油脂中的脂肪酸成分已見報道[6-7]。但越南安息香種子中含有較多不飽和脂肪酸，堿性太強的甲基衍生化試劑會使多不飽和雙鍵發(fā)生異構(gòu)化和降解[8]，因此對于越南安息香種子中脂肪酸的測定需要選擇合適的衍生化試劑。

采用在線甲基化-氣相色譜/質(zhì)譜法研究越南安息香果實中的脂肪酸的組成，對影響測定的主要因素如甲基化試劑、衍生化溫度、色譜柱等進行優(yōu)化，旨在建立越南安息香果實脂肪酸的測定方法。分別測定其種子油，種仁、種殼等的脂肪酸成分，并采用主成分分析進行數(shù)字化表征。比較安息香果仁與食用油的脂肪酸組成，以期為更好的開發(fā)越南安息香資源提供參考。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

Thermo氣相色譜儀, Thermo Trace DSQⅡ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Thermo Fisher公司);Py-3030iD雙擊式縱型微型爐裂解器(日本，F(xiàn)rontier Lab公司)。

三甲基氫氧化硫(TMSH，0.2 mol/L甲醇溶液，日本東京化成工業(yè)株式會社)；四甲基氫氧化銨 (TMAH，25%甲醇溶液，Aldrich Chemical Company)；甲醇(分析純，衢州巨化試劑公司)；4組越南安息香種子：產(chǎn)地分別為浙江泰順、福建南平、福建永安、江西吉水，種子油樣品由產(chǎn)地為浙江的安息香榨取，安息香樣品均由浙江林科院提供；食用油：大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油、金龍魚一代調(diào)和油均購于超市。

1.2 樣品制備

液體樣品制備：用分析天平稱取越南安息香種子油及各種食用油樣品各5.00 mg，甲醇定容至 1.00 mL。

圖1 在線甲基化-GC(/MS)分析裝置示意圖

固體樣品制備：將越南安息香種子碾碎，混合均勻后取約0.3 mg安息香果仁和果殼進樣。

1.3 實驗步驟

取上述樣品液體1 μL 或約0.3 mg固體加入到樣品杯，加入2 μL 0.2 mol/L衍生化試劑，將樣品杯固定在進樣桿上，裝入裂解器，待儀器穩(wěn)定后，按下進樣桿使樣品杯自由落到預(yù)先設(shè)定溫度的爐心，樣品受熱后瞬間發(fā)生甲基化反應(yīng)，生成的產(chǎn)物立即由載氣帶入氣相色譜儀進行測定。裝置見圖1。

1.4 色譜條件

氣相色譜：DB-23色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫：初溫50 ℃，以10 ℃/min速率升到 240 ℃，保持10 min。汽化室和檢測器溫度均為240 ℃，分流比30 ∶1，載氣N2，柱流量1 mL/min。

裂解器：裂解爐溫度350 ℃，色譜進樣口溫度300 ℃。

質(zhì)譜：傳輸線溫度：280 ℃，電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度：280 ℃，質(zhì)譜掃描范圍40～650 amu，采用NIST譜庫進行比對分析。

1.5 定性和定量

采用標準品對照和質(zhì)譜解析方法定性。采用峰面積歸一化法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化試劑及溫度等條件的優(yōu)化

不同的衍生化試劑對脂肪酸的甲基衍生化的影響至關(guān)重要。脂肪酸甘油酯與衍生化試劑在高溫輔助下發(fā)生甲基衍生化反應(yīng)，生成相應(yīng)的脂肪酸甲酯，其原理見圖2。有文獻報道采用堿性較弱的三甲基氫氧化硫(TMSH)作為衍生化試劑能一定程度上減少多不飽和脂肪酸的異構(gòu)化現(xiàn)象[9]。圖3為采用TMSH和四甲基氫氧化銨(TMAH)兩種衍生化試劑共存下得到的安息香種子油的氣相色譜圖。比較圖3a與圖3b可知，飽和的硬脂酸甲酯(C18 ∶0)和單不飽和的油酸甲酯 (C18 ∶1)峰強度無明顯差異。在TMAH存在下(見圖3b)多不飽和的亞油酸甲酯(C18 ∶2)與亞麻酸甲酯(C18 ∶3)峰強度很弱，而有TMSH存在下(見圖3a)兩者的峰強度相對要強的多。結(jié)果表明采用TMSH使異構(gòu)化現(xiàn)象降低，檢測靈敏度較高。因此，選擇TMSH為甲基化試劑。

圖2 脂肪酸甘油三酯在TMSH共存下的在線甲基衍生化反應(yīng)示意圖

a.添加TMSH with TMSH;b.添加TMAH with TMAH

裂解爐溫度對反應(yīng)的影響亦很重要：溫度過低，衍生化反應(yīng)不完全；溫度過高，少量脂肪酸甘油酯易分解損失。分別考察了250、 300、 350和 400 ℃對硬脂酸(C18 ∶0)、油酸(C18 ∶1)和亞油酸(C18 ∶2)的甲基衍生化效果的影響，發(fā)現(xiàn)250 ℃時，由于低溫衍生化不完全， 3種脂肪酸的甲基衍生化物的色譜峰強度較低；隨著溫度的升高，峰強度逐漸增強，當溫度到達 350 ℃時，衍生化物色譜峰強度達到最大，并且在 350 ℃到 400 ℃基本不變。因此，在以下實驗中選擇裂解器溫度為 350 ℃。

并考察了UA-5與DB-23色譜柱的分離效果，結(jié)果表明，在DB-23柱上，各脂肪酸成分得到很好的分離，出峰順序為C16 ∶0、C18 ∶0、C18 ∶1、C18 ∶2與C18 ∶3，易于定性。

為考察方法的重現(xiàn)性，在以上優(yōu)化條件下，取安息香種仁樣品平行測定5次。結(jié)果表明，各脂肪酸峰面積的的質(zhì)量分數(shù)相對標準偏差(RSD)小于3.81%，表明方法的重現(xiàn)性良好，適合安息香種子中脂肪酸的定量分析。

2.2 樣品的在線甲基化-氣相色譜(/質(zhì)譜)分析

圖4 安息香種子油(a)、種子果肉(b)和果殼(c)的在線甲基化-GC圖

按實驗1.2節(jié)與1.3節(jié)，對壓榨得到的安息香種子油、安息香種子果肉和果殼進行了測定。圖4是安息香種子油(a)、種子果肉(b)和果殼(c)的在線甲基化-氣相色譜圖。比較圖4可見，種子油和種子果肉的色譜圖基本相似，主要為脂肪酸種類和含量都比較接近。而果殼與種子油的色譜圖則差別較大，從果殼中共鑒定出包括脂肪酸在內(nèi)的20余種化合物。其中含量較高的1到5號峰成分分別為鄰甲氧基苯酚、 3-羥基- 4-甲氧基甲苯、 4-乙基- 2-甲氧基苯酚、 2-羥基- 5-甲基苯乙酮和乙酸異丁香酚酯。其中鄰甲氧基苯酚和乙酸異丁香酚酯具有一定刺激性。但這部分物質(zhì)并未在圖4(a)壓榨種子油中觀察到，說明壓榨后經(jīng)過濾凈化等工藝處理步驟，這些物質(zhì)已經(jīng)基本被去除。

采用面積歸一化法定量，得出越南安息香果殼、果肉和油中各種脂肪酸的GC含量，其脂肪酸組成見表1。表1表明飽和脂肪酸主要有棕櫚酸(C16 ∶0)、硬脂酸(C18 ∶0)，不飽和脂肪酸主要有油酸(C18 ∶1)、亞油酸(C18 ∶2)和亞麻酸(C18 ∶3)等。不飽和脂肪酸總含量在安息香種子油、果肉及果殼中分別在81%～87%。亞麻酸、亞油酸等多不飽和脂肪酸含量接近50%，其中以亞油酸含量最高，達43.2%～47.3%。測得的脂肪酸組成與文獻報道[4]基本一致，說明該方法可行。油脂中的不飽和脂肪酸以及人體必需的亞油酸是評價油脂營養(yǎng)的兩個重要指標，以上結(jié)果表明安息香種子油脂具有較高的營養(yǎng)價值，有可能發(fā)展成為食用油脂的來源之一。

表1 越南安息香的脂肪酸組分及含量比較

2.3 樣品的主成分分析

為了考察不同產(chǎn)地的安息香種仁中脂肪酸組成是否相同，以及安息香油與食用油的脂肪酸組成是否接近，采用所建立的方法對4種不同產(chǎn)地的安息香種仁、6種食用油樣品進行了測定。以8個脂肪酸組分作為考察對象，采用歸一化法定量, 結(jié)果見表2。由表2可知，4組不同產(chǎn)地的安息香種仁脂肪酸組成相似，說明產(chǎn)地對其脂肪酸組成影響不大。除花生油外，安息香油與其他植物油相同均是C18 ∶2含量最高，其次是C18 ∶1和C16 ∶0。由表2可知越南安息香的多不飽和脂肪酸亞油酸(C18 ∶2)和亞麻酸(C18 ∶3)的相對含量與大豆油和葵花籽油相近，高于其他食用油。C18 ∶2和C18 ∶3必須由食物中攝取，而不能由機體自行合成，故而被稱為必需脂肪酸，具有調(diào)節(jié)人體血壓，促進新陳代謝，延緩細胞老化等功效。

為更直觀地比較10個油脂樣品，采用SPSS軟件對表2的結(jié)果進行相似性分析[10-12]。由相似矩陣可知，4個安息香種仁樣品之間的相關(guān)系數(shù)達到0.999以上，說明盡管產(chǎn)地不同，但分布在浙江、福建和江西的安息香樣品脂肪酸組成非常相近，與6種植物食用油的相關(guān)系數(shù)在0.963～0.991，表明安息香油的組成與食用油相似，且與玉米油最為相似，相關(guān)系數(shù)在0.987～0.990。

該方法簡便快速，無需前處理，定量準確，重現(xiàn)性良好。與傳統(tǒng)索式提取法等測定脂肪酸相比，大大縮短了檢測時間，且由于樣品用量少，可直接固體進樣分析，使對安息香種子中的果仁和果殼的組成分析成為可能。但在果殼測定中觀察到的10余種物質(zhì)是否在提油工藝中已經(jīng)完全去除，及對安息香油作為食用油的安全是否構(gòu)成影響還有待進一步研究。以上研究可為越南安息香種子油的綜合利用提供參考。

3 結(jié) 論

3.1 建立了測定越南安息香種仁、種殼及種子油中脂肪酸組成的在線甲基化-氣相色譜(/質(zhì)譜)法。越南安息香種子油中主要脂肪酸為棕櫚酸(C16 ∶0)、硬脂酸(C18 ∶0)，油酸(C18 ∶1)、亞油酸(C18 ∶2)和亞麻酸(C18 ∶3)，不飽和脂肪酸含量在84.5%以上，其中亞油酸含量最高，達47.29%，表明安息香種子油脂有可能成為食用油脂的來源之一。

3.2 越南安息香種子油中人體必需的多不飽和脂肪酸含量(C18 ∶2和C18 ∶3)與大豆油和葵花籽油相近，高于一般植物油，具有較高的營養(yǎng)價值。

3.3 對4種不同產(chǎn)地的越南安息香種仁與6種食用油的脂肪酸組成進行了分析，相似性分析的結(jié)果表明：不同產(chǎn)地的安息香種仁的脂肪酸組成相似，其脂肪酸組成與食用植物油相近，且與玉米油的組成分布最為接近，相關(guān)系數(shù)在0.987～0.990。

參考文獻：

[1]婁方明,李群芳,邱維維.氣質(zhì)聯(lián)用分析安息香的揮發(fā)性成分[J].中成藥,2010,32(10):1829-1831.

[2]柳新紅,李因剛,何小勇.白花樹研究進展[J].浙江林業(yè)科技,2008,28(5):61-64.

[3]肖復明,曾志光,楊樺,等.東京野茉他莉種子油營養(yǎng)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā).2005,17(3):344-345.

[4]顧雁蕾,葉興乾,柳新紅.東京野茉莉種仁與種子油的營養(yǎng)成分及理化特性研究[J].食品工業(yè)科技.2010,12:328-329.

[5]CHALLINOR J M.A pyrolysis-derivatisation-gas chromatography technique for the structural elucidation of some synthetic polymers[J].Journal of Analytical and Applied Pyrolysis,1989,16:323-333

[6]CHALLINOR J M.A rapid simple pyrolysis derivatisation gas chromatography-mass spectrometry method for profiling of fatty acids in trace quantities of lipids[J].Journal of Analytical and Applied Pyrolysis,1996,37:185-197.

[7]DING Jun-Kai.Astudy of identification method in the trace human fat and ten common animal and vegetable fats by capillary gas chromatography[J].Analytical Chemistry,1990,3:65-70.

[8]ISHIDA Y,KATAGIRI M,OHATNI H.Reaction efficiency of organic alkalis with various classes of lipids during thermally assisted hydrolysis and methylation[J].Jounrnal of Chromatography(A),2009,12(1):3296-3299.

[9]SUN Yang,TANG Chun-lan,WU Xiao-wen,et.Characterization of alkylphenol components in ginkgo biloba Sarcotesta by thermochemolysis-gas chromatography/mass spectrometry in the presence of trimethylsulfonium hydroxide[J].Chromatographia,2011,75(7):527-537.

[10]王麗麗,陳爽,陸璐,等.溫莪術(shù)揮發(fā)性成分的閃蒸-氣相色譜-質(zhì)譜法測定研究[J].林產(chǎn)化學與工業(yè),2010,30(1):17-21.

[11]王曉晴,鄭曉,潘再法,等.閃蒸-氣相色譜-質(zhì)譜法在煙用香精香料分析中的應(yīng)用研究[J].林產(chǎn)化學與工業(yè),2011,31(5):85-89.

[12]吳曉雯,張俊梅,潘再法,等.MC頂空萃取-熱解吸-GC/MS法研究香附指紋圖譜[J].林產(chǎn)化學與工業(yè),2012,32(1):93-98.