王秀娟　孫堯

【摘要】 目的：觀察乏氧條件下miRNA調(diào)節(jié)AMPK對胰腺β細胞發(fā)揮的作用。方法：經(jīng)細胞培養(yǎng)及Real-time PCR，觀察在乏氧條件下miR-29a通過AMPK調(diào)控胰島β細胞功能的發(fā)揮。結(jié)果：INS-1細胞，主要表達AMPKα2，其磷酸化AMPK活性在乏氧條件下增加。用Real time PCR檢測AMPK的表達，發(fā)現(xiàn)乏氧說明在胰腺β細胞，主要表達AMPKα2亞基。乏氧能促進HIF-1α表達，促進AMPK的活化。同時AMPK可能受miR-29a的調(diào)節(jié)。結(jié)論：乏氧條件下胰島β細胞主要表達為AMPKa2，說明AMPK能促進胰島β細胞細胞增殖。

【關(guān)鍵詞】 AMPK； 胰腺β細胞； 乏氧； miR-29a

【Abstract】 Objective：To explore the mechanism by which miRNA plays roles in pancreatic β cells through regulating AMPK under hypoxic condition. Method：Under the condition of lack of oxygen miR - 29 a by AMPK regulation islet beta cell function were observed by cell culture and Real - time PCR.Result：The INS-1 cell primarily expressed AMPKα2， which the phosphorylation activity of AMPK was increased under hypoxic condition. the expression of AMPK was detected by Real time PCR， which suggested that pancreatic β cells primarily expressed AMPKα2 under hypoxic condition. Hypoxia could accelerate the expression of HIF-1α and the activation of AMPK. Meanwhile， AMPK might be regulated by miR-29a.Conclusion：Under the condition of lack of oxygen islet beta cells mainly expressed as AMPKa2， AMPK can promote cell proliferation islet beta cells.

【Key words】 AMPK； Pancreatic β cells； Hypoxia； miR-29a

First-authors address：Hebei United University，Tangshan 063000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.023

胰腺是一腺體器官，內(nèi)分泌胰腺包括胰島，約有100～1000激素分泌細胞散布在外分泌組織和通過血管團相互聯(lián)系。胰島的功能主要是通過產(chǎn)生多種激素維持代謝平衡，這些激素調(diào)節(jié)血糖水平。胰腺β細胞的功能受很多分子的調(diào)控包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、各種代謝分子及microRNA（miRNA）等構(gòu)成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，精確調(diào)控其行為[1-3]。miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中。而乏氧上調(diào)miR-29a通過AMPK抑制胰腺β細胞增殖、促進凋亡及促進自噬。筆者采用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)的方法研究特分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 RPMI 1640培養(yǎng)液 RPMI 1640培養(yǎng)基干粉為Invitrogen產(chǎn)品，去離子水配制，每升加入2.0 g的碳酸氫鈉，充分溶解后用HCl調(diào)pH至7.4，0.22 μm濾膜過濾后4 ℃保存使用。

1.1.2 DMEM培養(yǎng)液 DMEM培養(yǎng)基干粉為Invitrogen 產(chǎn)品。去離子水配制，每升加入3.7 g的碳酸氫鈉，充分溶解后用HCl調(diào)pH至7.4，0.22 μm濾膜過濾后4 ℃保存使用。

1.1.3 D-Hanks液配制 1 L含有0.12 g Na2HPO4·7H2O，0.06 g KH2PO4，0.35 g NaHCO3，0.4 g KCl，8 g NaCl。

1.1.4 0.25%胰蛋白酶 1L D-Hanks液（pH 7.4）含有2.5 g胰酶，充分溶解后過濾除菌于4 ℃保存。

1.1.5 其他材料 細胞培養(yǎng)用各式培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板和其他耗材，均購自Corning公司。

1.1.6 10×PBS 室溫保存，使用時以水稀釋至1×PBS，調(diào)pH 7.4。

1.1.7 Real-time PCR相關(guān)試劑 Olig（dT）18、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑購自Promega公司；2×SYBR Green PCR Master Mix（Takara公司，日本），此混合物中含有dNTP、MgCl2、Taq DNA多聚酶、抗Taq單克隆抗體和SYBR Green I、II等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) INS-1細胞為本實驗室保存，培養(yǎng)在RPMI1640并含有2 mmol/L Gln，另外加100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，1 mmol/L丙酮酸鈉，完全的培養(yǎng)基含有10%滅活的胎牛血清，培養(yǎng)37 ℃，5% CO2條件下[4-5]。乏氧處理的條件是1% O2。

1.2.2 Real-time PCR 使用Primer Premier software 5.0軟件設(shè)計引物，DNA序列由上海生物工程有限公司合成，Real-time PCR擴增程序為：熱啟動95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s擴增40循環(huán)，最后0.5 ℃/s作融解曲線。使用Light Cycler軟件分析結(jié)果。目的基因與內(nèi)參Ct值各自通過標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換為濃度值，以各目的基因和GAPDH基因的濃度比值表示mRNA的相對水平[6-8]。endprint

2 結(jié)果

2.1 乏氧條件下胰島β細胞AMPK的表達情況 為研究乏氧條件下胰島β細胞AMPK的表達情況，將INS-1細胞放于常氧和乏氧（1% O2）條件下培養(yǎng)，觀察不同乏氧時間4、12和24 h的AMPK表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在INS-1細胞，主要表達AMPKα2，其磷酸化AMPK活性在乏氧條件下增加（圖1）。用Real time PCR檢測AMPK的表達，發(fā)現(xiàn)乏氧說明在胰腺β細胞，主要表達AMPKα2亞基（圖2）。當(dāng)HIF-1α被抑制后，磷酸化AMPK下降，同時AMPK也下降。說明乏氧能促進HIF-1α表達，促進AMPK的活化（圖3）。

2.2 miR-29a調(diào)節(jié)AMPK在胰島細胞的表達 AMPK在胰島細胞有很重要的作用，筆者用生物學(xué)軟件對調(diào)節(jié)AMPK的3UTR的miRNAs進行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)AMPK的3UTR區(qū)有miR-29a結(jié)合位點，說明AMPK可能受miR-29a的調(diào)節(jié)，因此構(gòu)建了AMPK的3UTR的報告基因載體，證明了AMPK是miR-29a的靶基因（圖4）。將INS-1細胞在乏氧條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，乏氧能下調(diào)miR-29a的表達（圖5）。

3 討論

AMPK在細胞內(nèi)氧化應(yīng)激是活性增加。ROS誘導(dǎo)激活A(yù)MPK被認為對許多藥物的有益效果是非常重要的。例如，已報道二甲雙胍通過線粒體衍生的RNS激活A(yù)MPK。在小鼠骨骼肌AMPK被活化，氧化應(yīng)激和增強葡萄糖轉(zhuǎn)運，并不依賴于AMP或AMP/ATP比值的變化。同樣，在細胞培養(yǎng)條件下，缺氧誘導(dǎo)的AMPK活化依賴于線粒體ROS而AMP/ATP比值沒有顯著的變化[9]。過氧化氫已被觀察到，能夠強烈誘導(dǎo)活化AMPK。

線粒體尤其線粒體受損是細胞ROS產(chǎn)生的主要來源，線粒體損傷與許多慢性疾病有關(guān)如糖尿病，神經(jīng)退行性疾病和癌癥。AMPK可通過幾個機制調(diào)節(jié)線粒體ROS的產(chǎn)生[10]。解偶聯(lián)蛋白是線粒體陰離子載體蛋白的大家庭成員，解偶聯(lián)蛋白促進線粒體膜上的陰離子轉(zhuǎn)移。UCP2在控制線粒體ROS生產(chǎn)中起著重要的作用是治療肥胖、糖尿病及衰老的潛在靶點[11]。研究表明，一個在氧化還原調(diào)控AMPK的作用機制是通過上調(diào)線粒體UCP2表達。例如，通過AICAR激活A(yù)MPK，或過表達組成性激活A(yù)MPK，抑制O2生產(chǎn)和降低酪氨酸硝化前列環(huán)素合酶在人臍靜脈內(nèi)皮細胞在高糖處理[12]。AMPK參與NPY/刺鼠相關(guān)肽的作用。后者似乎是由于了UCP2表達的調(diào)控，導(dǎo)致神經(jīng)元的調(diào)控線粒體ROS的產(chǎn)生。培養(yǎng)MIN6胰島瘤細胞。此外，在動物模型，發(fā)現(xiàn)激活A(yù)MPK導(dǎo)致胰島UCP2表達的增加，此結(jié)果與在β細胞缺失的細胞結(jié)果一致[13]。盡管這些研究結(jié)果，AMPK調(diào)節(jié)UCP2表達和功能的詳細的機制仍然不完全清楚。新研究表明，AMPK調(diào)節(jié)自噬從而調(diào)節(jié)線粒體ROS的產(chǎn)生。眾所周知的，受損的蛋白質(zhì)和DNA的或不正常的線粒體可導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生ROS增強[14]。因此，細胞有各種特定的機制來控制這些受損細胞器，這樣的機制之一就是細胞自噬，從細胞中消除不正常的線粒體是至關(guān)重要的[14]。自噬缺陷導(dǎo)致生產(chǎn)ROS；這是由自噬功能失調(diào)的細胞或動物的許多實驗結(jié)果的支持。例如，從agt7缺陷小鼠的骨骼肌細胞表現(xiàn)為線粒體呼吸和ROS水平增加[15]。

筆者的研究發(fā)現(xiàn)乏氧條件下胰島β細胞主要表達AMPKα2，而AMPKα1表達很低，說明AMPK在細胞的表達存在組織特異性。進一步的結(jié)果說明AMPK能促進胰島β細胞細胞增殖。

參考文獻

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（收稿日期：2014-04-21） （本文編輯：蔡元元）endprint

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