高效液相色譜–光電二極管陣列法測(cè)定蝦青素的含量*

陳偉珠 ，張怡評(píng) ，晉文慧 ，洪專 ，易瑞灶

(1.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005； 2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361005)

蝦青素 (分子式為 C40H52O4，全稱 3，3’-二羥基 -4，4’-二酮基 -β，β’-胡蘿卜素 )是一種天然非維生素A 源的類胡蘿卜素。蝦青素廣泛存在于蝦、蟹、魚中，是一種具有超強(qiáng)抗氧化活性的次生類胡蘿卜素，比起類胡蘿卜素更容易被吸收和積累，是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)自然界最強(qiáng)的抗氧化劑，其抗氧化活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)有的抗氧化劑，蝦青素的抗氧化能力是維生素E的550倍，茶多酚的200倍，葡萄籽的60倍，β-胡蘿卜素、玉米黃素、葉黃素和角黃素等類胡蘿卜素的10倍，番茄紅素的7倍，被稱為“超級(jí)維生素E”［1-3］。蝦青素具有抑制腫瘤、抗氧化、抗癌變、增強(qiáng)免疫功能等多方面的生理作用，可用作抗癌變的預(yù)防治療劑、抗衰老劑、食品著色劑等，是一種具有很大發(fā)展前途的生物工程產(chǎn)品，因而在食品添加劑、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化妝品、保健品和醫(yī)藥工業(yè)方面有著廣闊的應(yīng)用前景［4-5］。

目前，蝦青素的檢測(cè)方法有分光光度法［6-7］、高效液相紫外法［8-10］、高效液相色譜 - 質(zhì)譜法［4-11］。高效液相色譜紫外法由于操作簡單成為目前蝦青素常規(guī)的檢測(cè)方法。筆者在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上建立了高效液相色譜紫外法檢測(cè)蝦青素的方法，該方法靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：2695型，配有光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器(PDA)，美國Waters公司；

分析天平：CPA2P型，德國Sartorius公司；

超純水機(jī)：Mili-Q型，德國Millipore公司；

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于99%，百靈威公司；

2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)：試劑純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：40 μg/mL，精密稱取2 mg蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，溶于BHT乙腈溶液，定容至50 mL，充氮?dú)庵?18℃冰箱保存；

BHT乙腈溶液：10 mg/mL，2.5 g BHT溶解于250 mL乙腈；

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司；

鹽酸、氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

30%雙氧水：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 HPLC色譜條件

色譜柱：Purospher STAR RP 18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫為30℃；流動(dòng)相：甲醇-水(體積比為95∶5)，流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長：482 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件的選擇

固定流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，比較甲醇-水體系和乙腈-水體系作流動(dòng)相對(duì)蝦青素進(jìn)行分離的效果。結(jié)果表明，甲醇-水體系的分離效果稍優(yōu)于乙腈-水體系，所以選擇甲醇-水體系作為流動(dòng)相體系?？疾旒状?水的不同配比對(duì)分離效果的影響，最終選擇甲醇-水(體積比為95∶5)作為流動(dòng)相。色譜圖如1所示。

2.2 專屬性考察

量取適量體積的蝦青素儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度為 4 μg/mL 的溶液，分別加入 HCl(1 mol/L)，NaOH(1 mol/L)，30% H2O2，高溫加熱進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化及加熱破壞試驗(yàn)，結(jié)果顯示各降解產(chǎn)物均可與蝦青素良好分離，色譜圖如圖2所示。

圖2 在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化及加熱破壞試驗(yàn)下的蝦青素譜圖對(duì)照

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限

分別精密量取不同體積的蝦青素儲(chǔ)備液稀釋至刻度并搖勻，得到質(zhì)量濃度為 0.2，0.4，1，2，4，8，16 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。以色譜峰面積(Y)對(duì)溶液質(zhì)量濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=147780X-3453.8，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明，蝦青素在0.2～16 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性。以S/N=3計(jì)算得檢出限為0.01 μg/mL，以S/N=10計(jì)算得定量限為0.05 μg/mL。

表1 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定結(jié)果

2.4 回收試驗(yàn)

取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，分別用BHT乙腈溶液溶解并定容配制成不同質(zhì)量濃度水平的溶液各3份，作為供試溶液進(jìn)行回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，平均回收率為96.6%～105.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.52%，表明本法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

取一定體積蝦青素儲(chǔ)備液，加BHT乙腈溶液配制成4 μg/mL蝦青素溶液，作為供試溶液。精密吸取20 μL進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，本法精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取4 μg/mL蝦青素供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果見表 4。由表4可知，供試品溶液在24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜測(cè)定蝦青素含量的方法，該方法的檢出限低于文獻(xiàn)報(bào)道方法的檢出限且線性范圍寬，回收率好，靈敏度高，精密度好，可滿足蝦青素相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)分析。

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