崔辰，趙世華

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，心血管病已經(jīng)成為全球人口的最主要死因[1]。心肌梗死造成心肌細(xì)胞不可逆的損害，隨著病程的進(jìn)展，最終逐漸惡化為心力衰竭，嚴(yán)重危害患者的生命和生活質(zhì)量[2]，亟需一種能有效的促進(jìn)心肌細(xì)胞再生和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的治療手段。而干細(xì)胞有著促進(jìn)組織和血管再生的能力[3]，利用干細(xì)胞的移植治療心肌梗死是一種有著極大的臨床應(yīng)用前景的新興治療手段。

但目前這種治療手段還面臨著種種困難。首先，對(duì)其改善心功能作用的機(jī)理認(rèn)識(shí)不足，沒有足夠的證據(jù)能夠證明在人體內(nèi)有足夠的移植細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[3-4]。其次，且難以解釋基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中干細(xì)胞移植對(duì)心功能改善遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過臨床試驗(yàn)的原因[5-6]。另外，細(xì)胞移植后去向不明確，最終存留在心肌組織中的細(xì)胞量十分稀少[7]，需要對(duì)各種移植途徑的效果進(jìn)行對(duì)比評(píng)估。為了回答以上問題，解決在臨床試驗(yàn)中的疑惑，探索理想的種子細(xì)胞和移植方式，找到一種理想的用于移植干細(xì)胞示蹤的方法極為必要。傳統(tǒng)的示蹤方法主要是組織學(xué)檢查，但該方法存在諸多的缺陷，如需要取材和無法連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察等。在基礎(chǔ)和臨床研究中需要一種非侵入、可連續(xù)檢測(cè)的細(xì)胞示蹤法。

心臟MRI作為心功能檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，在生物材料、生物工程技術(shù)的支持下，特別是結(jié)合分子探針，可作為長時(shí)程監(jiān)測(cè)細(xì)胞的移植和遷移情況的手段[8]，能同時(shí)提供精確的解剖定位、心功能以及心肌存活的情況。本文對(duì)現(xiàn)階段通過MRI手段示蹤移植干細(xì)胞的方法做一綜述。

1 超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記干細(xì)胞成像

超順磁性氧化鐵 (SPIO)作為一種細(xì)胞示蹤劑已得到廣泛應(yīng)用，因其能影響空間磁場(chǎng)的均一性，可在高濃度時(shí)降低T1和T2值，而對(duì)T2*值影響最大。由于加快了水平方向各個(gè)自旋失相位的速度，在T2*WI上可以顯示為邊界清晰的低信號(hào)(信號(hào)缺失)。超順磁性氧化鐵顆粒大小和在體內(nèi)的代謝途徑各不相同，依照其直徑大小分為：直徑為15～20 nm的單晶體氧化鐵納米顆粒(monocrystalline iron oxidenanoparticles，MION)，因直徑最小，在血液中有很長的半衰期(10 h以上)，多用于MRA、淋巴結(jié)和腫瘤的成像； 直徑在20～40 nm之間的超小型超順磁性氧化鐵顆粒(ultra-small superparamagnetic iron oxide，USPIO)，臨床上常用于檢查腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移；直徑在40～150 nm之間的超順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)，因其靜脈注射后聚集于肝臟、脾臟和內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)，常用作肝臟檢查的對(duì)比劑；以及直徑從一個(gè)微米到幾個(gè)微米的，微米級(jí)超順磁性氧化鐵顆粒(micrometersized SPIO；MPIO)，該微粒目前主要應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記細(xì)胞[9-11]。以上各種顆粒其組成大多是左旋糖苷包裹的帶磁性的鐵核心，在介導(dǎo)物(多聚賴氨酸或魚精蛋白)的參與下被攝入細(xì)胞內(nèi)，一旦氧化鐵粒子進(jìn)入細(xì)胞后，就可使被標(biāo)記的細(xì)胞在MRI中顯示為低信號(hào)。目前大多試驗(yàn)認(rèn)為鐵顆粒不會(huì)對(duì)人類干細(xì)胞的主要特性造成明顯的影響[12]。

目前完成的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均以不同途徑(經(jīng)心肌、經(jīng)靜脈、經(jīng)皮心內(nèi)膜或經(jīng)皮冠脈內(nèi))在心梗動(dòng)物模型體內(nèi)植入鐵顆粒標(biāo)記的干細(xì)胞，隨后在不同的時(shí)間點(diǎn)比較MRI的影像學(xué)表現(xiàn)(局限的低信號(hào))和組織學(xué)上鐵顆粒標(biāo)記干細(xì)胞(鐵染色)的情況來考察用鐵顆粒作為干細(xì)胞示蹤劑的可能性。

1.1 靶器官示蹤成像

早在2003年Kraitchman等[13]和Hill等[14]分別于不同實(shí)驗(yàn)中，在豬的心梗模型中應(yīng)用氧化鐵粒子標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，在3周內(nèi)利用MRI評(píng)估，證實(shí)利用此方法可以在活體的水平下確認(rèn)經(jīng)導(dǎo)管移植干細(xì)胞的移植位點(diǎn)。Stuckey等[15]在觀察到了經(jīng)標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞在MRI的低信號(hào)區(qū)的面積與心臟的射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為可能由于受損更嚴(yán)重的心臟引起更多的干細(xì)胞遷移并停留，從而增加了低信號(hào)區(qū)的面積。國內(nèi)也有有研究證實(shí)在豬心梗模型內(nèi)利用氧化鐵顆粒對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞示蹤的可行性[16-17]。

1.2 干細(xì)胞的歸巢成像

由于干細(xì)胞有向受損組織歸巢的能力，許多研究試圖利用靜脈注射的方式移植干細(xì)胞，并用MRI的手段示蹤干細(xì)胞遷移的情況。Carr等[18]在大鼠模型心梗中利用MPIO標(biāo)記的干細(xì)胞經(jīng)靜脈移植，移植后10周發(fā)現(xiàn)了低信號(hào)帶，在活體的水平上利用MRI證實(shí)了經(jīng)靜脈移植的干細(xì)胞的向心梗組織處遷移并停留。在2011年Yang等[19]在小鼠骨髓中植入了MPIO標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞，在2周內(nèi)行連續(xù)MRI檢查并觀察到梗死區(qū)域逐漸出現(xiàn)低信號(hào)區(qū)，且信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低，其面積也隨時(shí)間的推移而增加，表示干細(xì)胞逐漸遷移到此區(qū)域。該實(shí)驗(yàn)也提供了氧化鐵粒子標(biāo)記法可以追蹤細(xì)胞遷移的證據(jù)[19]。

然而，需要注意的是，目前關(guān)于MRI SPIO標(biāo)記干細(xì)胞歸巢示蹤成像的結(jié)果并不一致。如Kraitchaman等[20]于2005年在急性心梗的犬模型3 d后經(jīng)靜脈注射SPIO和核素共同標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞，但并沒有在MRI中監(jiān)測(cè)到被移植的干細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)中示蹤的失敗可能與實(shí)驗(yàn)條件的差異有關(guān)。

1.3 SPIO標(biāo)記干細(xì)胞示蹤的局限性

標(biāo)記的特異性較低。MRI僅能通過由于鐵顆粒引起的低信號(hào)間接判斷干細(xì)胞的存在，而不能區(qū)分鐵顆粒到底是在干細(xì)胞內(nèi)，巨噬細(xì)胞內(nèi)，還是在細(xì)胞間質(zhì)。Amsalem等[21]在對(duì)干細(xì)胞移植后的心肌行組織學(xué)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)在鐵顆粒標(biāo)記的干細(xì)胞的注射位點(diǎn)有大量的巨噬細(xì)胞浸潤，經(jīng)普魯士藍(lán)和ED1染色后，證實(shí)大部分含鐵細(xì)胞為組織巨噬細(xì)胞。Terrovitis等[22]利用SPIO和β半乳糖苷酶共同標(biāo)記的人(異種)和鼠(同種)的心臟源干細(xì)胞分別經(jīng)心肌移植到大鼠體內(nèi)并行MRI檢查，兩者均可見圓形低信號(hào)區(qū)。因?yàn)楫惙N的心臟源干細(xì)胞會(huì)引起大鼠的排異反應(yīng)，在3周內(nèi)所有的人心臟源干細(xì)胞都會(huì)死亡。經(jīng)免疫組化檢查證實(shí)了大部分鐵顆粒并不在干細(xì)胞內(nèi)而在巨噬細(xì)胞中，因此SPIO示蹤法不能證實(shí)細(xì)胞的存活。Winter等[23]也用實(shí)驗(yàn)也支持前兩者的觀點(diǎn)，他分別利用經(jīng)氧化鐵標(biāo)記的死亡和存活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，證明不論被標(biāo)記細(xì)胞是否存活，都會(huì)使MRI產(chǎn)生低信號(hào)區(qū)，而且在6周內(nèi)，低信號(hào)區(qū)的位置和大小不改變，組織學(xué)檢查證實(shí)在注射死細(xì)胞區(qū)域的鐵粒子均在巨噬細(xì)胞中。由于炎癥反應(yīng)和不良的微環(huán)境，移植的細(xì)胞會(huì)大量死亡，細(xì)胞崩解后釋放的鐵顆粒會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬。Himes等[24]的研究表明，未被吞噬的氧化鐵鐵粒子會(huì)在12 h內(nèi)消失，但Chen等[25]連續(xù)觀察心梗處的游離氧化鐵粒子，證實(shí)游離的氧化鐵顆粒會(huì)在纖維化的組織間隙之間長達(dá)16 d以上，在MRI上可顯影長達(dá)42 d，研究的差異可能與氧化鐵粒子注射的量和不同的動(dòng)物模型有關(guān)。而其他實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)移植后一段時(shí)間內(nèi)，氧化鐵粒子被巨噬細(xì)胞吞噬[25-27]。由于炎癥反應(yīng)或干細(xì)胞自行凋亡引起氧化鐵粒子被巨噬細(xì)胞吞噬或在組織間隙存留，這些現(xiàn)象會(huì)造成對(duì)干細(xì)胞檢測(cè)的假陽性而高估了其存活時(shí)間，因而巨噬細(xì)胞與干細(xì)胞的相互作用以及干細(xì)胞的凋亡是決定示蹤成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而個(gè)別研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞能長時(shí)間存活，且心梗區(qū)域沒有巨噬細(xì)胞的浸潤。Stuckey等[15]在大鼠心梗模型經(jīng)心肌注射標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過MRI在移植后16周觀測(cè)到低信號(hào)區(qū)，經(jīng)組織學(xué)檢查證實(shí)干細(xì)胞聚集區(qū)域沒有巨噬細(xì)胞；Yang等[28]于2011年對(duì)移植到豬心梗模型中的干細(xì)胞進(jìn)行了長達(dá)8周的觀察，發(fā)現(xiàn)影像學(xué)表現(xiàn)和組織學(xué)檢驗(yàn)吻合，且經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，證實(shí)含鐵細(xì)胞的CD68染色為陰性，即鐵顆粒沒有被巨噬細(xì)胞吞噬。

理論上由于標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞的氧化鐵顆粒的數(shù)目有限，每次細(xì)胞分裂就會(huì)使細(xì)胞中的氧化鐵顆粒數(shù)量減半，當(dāng)細(xì)胞中的氧化鐵粒子濃度被稀釋到一定程度時(shí)，會(huì)使低信號(hào)區(qū)逐漸變淡，甚至消失。在Terrovitis等[22]的實(shí)驗(yàn)中，隨著標(biāo)記細(xì)胞持續(xù)的在培養(yǎng)基中擴(kuò)增，細(xì)胞中的鐵粒子會(huì)逐漸減少，第三周時(shí)幾乎所有細(xì)胞的鐵染色均為陰性，他們認(rèn)為其原因是細(xì)胞分裂產(chǎn)生的稀釋效應(yīng)。Chen等[25]在實(shí)驗(yàn)中觀察到，隨著時(shí)間的變化，低信號(hào)區(qū)域由擴(kuò)散變得集中，并認(rèn)為有些內(nèi)源性細(xì)胞清除并聚集了鐵粒子。

1.4 SPIO標(biāo)記干細(xì)胞示蹤法的改良

不斷地探索新的標(biāo)記方法、改進(jìn)氧化鐵顆粒的性質(zhì)、運(yùn)用新的序列可以改進(jìn)成像的效果。通過多種成像方式的結(jié)合可以在精確定位細(xì)胞的同時(shí)顯示細(xì)胞的存活情況，Zhang等[27]在通過SPIO的標(biāo)記定位干細(xì)胞注射位點(diǎn)利用生物發(fā)光成像提供細(xì)胞的存活信息，成功的在2個(gè)月內(nèi)連續(xù)觀察胚胎干細(xì)胞在大鼠體內(nèi)的變化。Qiao等[26]也利用PET報(bào)告基因成像與SPIO標(biāo)記相結(jié)合試圖探測(cè)細(xì)胞的存活和細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的關(guān)系。另有研究者在活體內(nèi)標(biāo)記干細(xì)胞，避免了體外標(biāo)記時(shí)造成污染的可能，且獲得了更高的標(biāo)記效率[29]。更多新序列的研發(fā)也提高了成像的敏感性，Mani等[30]利用新的GRASP序列使SPIO顯示為高信號(hào)，使得移植位點(diǎn)更易被辨識(shí)。另外，通過改進(jìn)SPIO表面的結(jié)構(gòu)可以提高標(biāo)記效率，讓更多的氧化鐵粒子進(jìn)入細(xì)胞中[31]。

2 MR報(bào)告基因成像

考慮到SPIO直接標(biāo)記法的局限性，人們?cè)噲D用其他方式對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行示蹤，而最有研究價(jià)值的是報(bào)告基因成像技術(shù)。由于只有存活的細(xì)胞才能不斷地表達(dá)報(bào)告基因，合成出使其能在影像設(shè)備上顯影的蛋白，因此報(bào)告基因成像技術(shù)可以驗(yàn)證細(xì)胞的存活。在目前，報(bào)告基因成像技術(shù)常用的成像手段有：生物發(fā)光成像、核素成像和MRI。利用報(bào)告基因產(chǎn)生MRI對(duì)比信號(hào)的方式多種多樣，而原理各不相同，簡言之就是給細(xì)胞導(dǎo)入一個(gè)可以編碼可探測(cè)到的蛋白探針的基因(報(bào)告基因)，通過該基因的持續(xù)或經(jīng)調(diào)控的表達(dá)而成像。

2.1 組成性基因的超表達(dá)

利用基因工程引入啟動(dòng)子可以使某種組成性基因超量表達(dá)產(chǎn)生影響T1和T2弛豫時(shí)間的蛋白質(zhì)。鐵蛋白作為一種普遍存在于細(xì)胞中的儲(chǔ)鐵蛋白質(zhì)得到了廣泛應(yīng)用。由于編碼鐵蛋白的基因的過量表達(dá)，含鐵的蛋白質(zhì)會(huì)隨著細(xì)胞的存活不斷生成，明顯增加細(xì)胞內(nèi)的鐵含量。過量的鐵影響局部磁場(chǎng)的均一而在MRI上顯示出示蹤的目標(biāo)。Naumova等[32]在2010年最早將此技術(shù)運(yùn)用于心梗后移植的干細(xì)胞示蹤，通過使鼠成骨骼肌細(xì)胞鐵蛋白基因超量表達(dá)，使MR T2*WI中的細(xì)胞移植區(qū)產(chǎn)生低信號(hào)區(qū)。此區(qū)域與對(duì)照組相比減少了25%的弛豫時(shí)間。經(jīng)組織學(xué)驗(yàn)證，成像中的移植物面積與組織學(xué)中的移植細(xì)胞散布面積高度相關(guān)(r=0.8)。在2012年該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)用多種不同檢查序列探索最優(yōu)的成像方式，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了之前的定量關(guān)系，與組織學(xué)對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)在T2 iMSDE 和 T2 GRE序列上分別為0.79和0.89[33]。Campan等在4周內(nèi)利用相似的原理對(duì)豬心球樣細(xì)胞進(jìn)行示蹤，并在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其引入的基因不會(huì)改變細(xì)胞的分化和分裂能力。

2.2 特異性SPIO示蹤

Chung等[34]的研究應(yīng)用另一種原理實(shí)現(xiàn)了MRI報(bào)告基因成像，利用基因工程手段使報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物分布于細(xì)胞表面形成抗原，同時(shí)將相應(yīng)的單克隆抗體與SPIO結(jié)合作為分子探針。與移植細(xì)胞相結(jié)合的分子探針通過SPIO的作用成像。2011年，他們通過慢病毒載體將報(bào)告基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞，將其注射在心梗后小鼠模型的心肌內(nèi)，分別于3 d到2周內(nèi)連續(xù)行MRI檢查，自第5天起心臟短軸圖像上顯示出低信號(hào)移植位點(diǎn)，證實(shí)了移植細(xì)胞的存活。此方法解決了傳統(tǒng)SPIO標(biāo)記法特異性低的弊端，然而其局限性在于每次檢查后與抗原結(jié)合的抗體會(huì)影響下次成像的結(jié)果；而且由于外源性的抗原導(dǎo)入，勢(shì)必會(huì)引起免疫反應(yīng)。

MRI報(bào)告基因成像雖然前景可觀，但其安全性和可靠性還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

3 小結(jié)

利用超順磁性氧化鐵粒子可以在活體水平精確定位干細(xì)胞的移植位點(diǎn)，但是由于低信號(hào)影只與氧化鐵顆粒的存在有關(guān)而與細(xì)胞的存在和種類無關(guān)，這種示蹤方法不能提供細(xì)胞存活、增殖、分化的直接證據(jù)。如果排除巨噬細(xì)胞的干擾，延長干細(xì)胞存活的時(shí)間，則可以實(shí)現(xiàn)在一定時(shí)間內(nèi)利用SPIO的直接標(biāo)記對(duì)干細(xì)胞示蹤，但目前各種實(shí)驗(yàn)方法選用的鐵顆粒大小、標(biāo)記方式、干細(xì)胞的種類、移植的方式、移植的時(shí)間點(diǎn)、MRI設(shè)備的場(chǎng)強(qiáng)和觀察的時(shí)間點(diǎn)均不一致，因此結(jié)果也大相徑庭，就炎癥細(xì)胞對(duì)SPIO示蹤能力的干擾程度還沒有達(dá)到統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。而MRI報(bào)告基因成像在一定程度上避免了傳統(tǒng)SPIO直接標(biāo)記細(xì)胞示蹤的劣勢(shì)，因其成像的原理保證了圖像信號(hào)與蛋白質(zhì)表達(dá)(細(xì)胞存活)的一致性，但其工序復(fù)雜，安全性也未得到證實(shí)。我們?cè)诹私釳RI方法示蹤移植干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)時(shí)，也應(yīng)充分的認(rèn)識(shí)到其局限性，綜合利用以達(dá)到更好的示蹤效果。同時(shí)我們也期待著技術(shù)的進(jìn)步，克服目前所面臨的種種限制，為實(shí)現(xiàn)“基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化”掃清障礙。

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