固定化α-淀粉酶的制備及性能研究

耿志杰，林松柏，陳 軍，許少波，劉群峰，張澤榮，張 錦

1.廣東省醫(yī)療器械研究所 國家醫(yī)療保健器具工程技術研究中心，廣東 廣州 510500；2. 華僑大學，福建 廈門 361021；3.黎明大學，福建 泉州 362000

α-淀粉酶用于水解淀粉，切斷α-1,4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生麥芽糖、葡萄糖、寡糖和糊精等，作為一種重要的生物催化劑，具有高效、專一，反應條件溫和的優(yōu)良特性，廣泛應用于生物醫(yī)藥、食品加工、啤酒釀造、石油化工等領域[1-3].但游離酶對外界環(huán)境(有機溶劑、酸堿、熱等)極其敏感，易失活變性，并且在工業(yè)生產(chǎn)中游離酶混入產(chǎn)品后，分離、純化困難，難以回收重復利用.由于游離酶存在這些缺陷，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應用[4-5].選用合適的載體材料，采用物理或化學的方法進行酶的固定化，所得固定化酶不僅保留了酶原有的高活性、高選擇性，克服了游離酶的缺點，而且有益于反應的連續(xù)化和自動化，在工業(yè)生產(chǎn)上具有極高的應用價值，因而具有廣闊的發(fā)展前景[6].

采用傳統(tǒng)的無機/有機復合材料或天然高分子固體材料為載體進行α-淀粉酶的固定化，由于受到載體材料的影響，實現(xiàn)α-淀粉酶重復利用性的同時，酶活性卻大大降低.基于水凝膠具有三維網(wǎng)絡結構，能夠吸收大量的水，溶脹而不溶解的性質(zhì)，能夠提供酶催化反應所需的微環(huán)境，保證酶分子的活性構象運動.本文以具有生物相容性的P(DMAA-co-AM)凝膠為載體固定α-淀粉酶，提高了α-淀粉酶的使用性能.

1 主要實驗試劑

丙烯酰胺(AM，廣東汕頭西隴化工廠)；N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA，南通沃蘭化工有限公司)；α-淀粉酶(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)；過硫酸銨(APS，廣東汕頭西隴化工廠)；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA，國藥集團化學試劑有限公司)；可溶性淀粉(廣東汕頭西隴化工廠).

2 固定化α-淀粉酶的制備

分別取一定量的 N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和丙烯酰胺 (AM)溶于去離子水中，配成混合溶液，然后加入適量α-淀粉酶溶液充分攪拌，使其形成均勻的混合液，再加入一定量的交聯(lián)劑(N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA))和引發(fā)劑(過硫酸銨(APS))，攪拌均勻便得到反應混合液.于50 ℃水浴鍋中充分反應一定時間，即可得到P(DMAA-co-AM)固定化α-淀粉酶凝膠粗樣.最后用緩沖溶液充分沖洗制得的固定化α-淀粉酶凝膠粗樣，把附著在固定化酶凝膠表面的游離α-淀粉酶沖洗掉，即得固定化α-淀粉酶.

3 結果與討論

3.1 溫度對固定化α-淀粉酶活性的影響

圖1為溫度對固定化α-淀粉酶和游離酶活性的影響.由圖1可見，在30～90 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，固定化酶和游離酶的活性均呈先升后降的趨勢.游離酶的活性在50 ℃時達到最大，而固定化酶的最大活性溫度提高10℃.當反應溫度超過固定化酶和游離酶各自的最大活性溫度后，隨著溫度升高，游離酶活性降低的趨勢較固定化酶活性降低的趨勢更顯著，說明在較高溫度下固定化酶較游離酶具有較好的穩(wěn)定性.這是因為，α-淀粉酶被載體P(DMAA-co-AM)凝膠固定后，載體對α-淀粉酶分子構象具有一定的保護作用，使固定化酶的活性受溫度的影響降低.

圖1 溫度對α-淀粉酶活性的影響

Fig.1Influence of temperature on relative activity of a-amylase

3.2 pH對固定化α-淀粉酶活性的影響

圖2為pH對固定化α-淀粉酶和游離酶活性的影響.由圖2可知，在pH為5.0～8.0的范圍內(nèi)，固定化酶和游離酶的活性隨反應液pH的增大均呈先升后降的趨勢，實驗測得最適pH分別為6.0和6.6，但固定化酶的最適pH有所拓寬.對于游離酶，當反應液pH大于6.0后，繼續(xù)增大pH，其活性明顯降低；而在pH為6.6～7.6范圍內(nèi)，固定化酶保持較高的活性，pH超過7.6后，隨pH的增大，固定化酶的活性急劇降低.這是因為，酶是一種蛋白質(zhì)，構成酶分子的氨基酸殘基的解離狀態(tài)影響酶分子中的電荷分布，從而影響不同pH條件下的酶活性，催化產(chǎn)物呈現(xiàn)的電性也影響酶的最適pH.α-淀粉酶分解可溶性淀粉，生成以麥芽糖為主的產(chǎn)物，在pH<7的環(huán)境中-OH中的H易解離出來，改變?nèi)芤旱膒H大小，導致固定化酶的最適pH向高pH處偏移.在可溶性淀粉的分解中，α-淀粉酶的催化能力對pH很敏感，當反應液pH值高于最適pH值后，游離酶的活性明顯降低，游離酶的催化能力急劇下降.而α-淀粉酶被P(DMAA-co-AM)凝膠固定后，α-淀粉酶分子結構受到凝膠網(wǎng)絡的保護，使其在較高的pH范圍仍具有較好的活性，說明固定化酶活性對pH具有很好的穩(wěn)定性.

圖2 pH對α-淀粉酶活性的影響

3.3 酶促反應動力學

圖3 固定化α-淀粉酶和游離酶的米氏方程

Fig.3Michaelis-Menten Kinetics equation of free and immobilization a-amylase

本實驗中，取適量的固定化α-淀粉酶和游離酶分別與20 mL不同濃度的可溶性淀粉溶液在各自適宜的pH和溫度下精確反應20 min，計算出其反應速率，然后用雙倒數(shù)作圖法以1/V對1/[S]作圖，得到圖3.游離酶的米氏方程為：Y=0.39047+2.01403X，R=0.9976(Y代表1/V，X代表1/[S]，下同)；固定化α-淀粉酶的米氏方程為：Y=1.92746+2.56425X，R=0.9988.結合米氏方程，由圖3求出游離酶的米氏常數(shù)(Km)和最大反應速率(Vmax)分別為5.16 mg/mL和2.56 mg/min；固定化酶的米氏常數(shù)(Km)和最大反應速率(Vmax)分別為1.33 mg/mL和0.52 mg/min.固定化α-淀粉酶的米氏常數(shù)小于游離酶的，說明固定化酶具有更好的底物親和性.P(DMAA-co-AM)凝膠網(wǎng)絡與α-淀粉酶分子間的物理或化學作用，促使固定化α-淀粉酶更傾向于與淀粉溶液親和.固定化α-淀粉酶的最大反應速率小于游離酶的，是由于游離酶均勻地分散在淀粉溶液中，而固定化α-淀粉酶被束縛在P(DMAA-co-AM)凝膠網(wǎng)絡中，與淀粉溶液的接觸機會少于游離酶與淀粉溶液的接觸機會，導致固定化酶的Vmax較小.

3.4 固定化α-淀粉酶的操作穩(wěn)定性

圖4 固定化α-淀粉酶的操作穩(wěn)定性

Fig.4The operational stability of immobilization a-amylase

圖4是固定化α-淀粉酶重復操作6次表現(xiàn)出的穩(wěn)定性.在溫度為60 ℃和pH=6.6的條件下，適量的固定化α-淀粉酶與20 mL質(zhì)量分數(shù)1%的可溶性淀粉溶液反應，測出其酶活力，計第一次測得的酶活為100%，以重復6次反應的酶相對活性作柱狀圖得圖4.由圖4可知，固定化α-淀粉酶重復操作6次后，酶活仍可達到73%，說明固定化α-淀粉酶的操作穩(wěn)定性良好.酶活下降的主要原因是，在制備固定化α-淀粉酶的過程中，為將粘附在固定化酶凝膠表面的游離α-淀粉酶除去，雖然用緩沖溶液充分洗滌，但在實際操作中仍會有部分游離酶粘附在固定化酶凝膠表面未被除掉.因此，固定化α-淀粉酶重復操作時，不可避免地會有α-淀粉酶流失，致使循環(huán)使用α-淀粉酶分解可溶性淀粉時酶活性表現(xiàn)出依次降低的現(xiàn)象.

3.5 固定化α-淀粉酶的儲存穩(wěn)定性

將固定化α-淀粉酶和游離酶儲存在4 ℃冰箱中每隔10天分別測其酶活性，其中分別計其初始酶活為100%，固定化酶和游離酶受儲存時間的影響如圖5所示.從圖5可以看出，儲存一定時間后，固定化α-淀粉酶的活性較游離酶降低趨勢平緩；儲存70天后，固定化α-淀粉酶可保持近60%的酶活，而游離酶的活性已降至26%.因為游離的α-淀粉酶經(jīng)儲存后，酶分子構象發(fā)生變化，酶活性下降，而固定化α-淀粉酶因受載體保護，分子構象不易改變，使固定化酶活性下降趨勢減緩，因此固定化α-淀粉酶的儲存穩(wěn)定性較游離酶明顯提高.

圖5 游離酶和固定化α-淀粉酶的儲存穩(wěn)定性

Fig.5The storage stability of free and immobilization a-amylase

4 結 論

以P(DMAA-co-AM)凝膠為載體，通過原位固定法制備了固定化α-淀粉酶，改善了游離酶理化性質(zhì)不穩(wěn)定、易失活變性，不能重復使用等缺點.固定化酶具有更好的底物親和性，固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)(Km)分別為1.33，5.16 mg/mL，最大反應速率(Vmax)分別為0.52，2.56 mg/min.與游離酶相比，固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性.固定化α-淀粉酶的活性最適溫度為60℃，較游離酶提高了10 ℃；固定化α-淀粉酶的酶活最適pH由游離酶的6.0提高到了6.6.α-淀粉酶經(jīng)載體固定后具有更好的溫度和pH穩(wěn)定性，同時拓寬了α-淀粉酶的溫度和pH使用范圍.α-淀粉酶經(jīng)過載體固定化后的性能得到明顯改善，這為α-淀粉酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應用提供了重要依據(jù).

參考文獻：

[1] 馮健飛.α-淀粉酶的應用及研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010(17):354-355.

[2] 王慧超，陳今朝，韓宗先.α-淀粉酶的研究與應用[J].重慶工商大學學報，2010，27(4)：368-372.

[3] 李勃，黨永，馬瑜，等.黑曲霉Tx-78耐酸性α-淀粉酶的分離純化及其性質(zhì)研究[J].微生物學雜志，2008，28(4)：30-34.

[4] MANZANO M F G,IGARZABAL C I A.Immobilization of lipase from Candida rugosa on synthesized hydrogel for hydrolysis reaction[J].Molecular Catalysis B: Enzymatic，2011,72(1-2):28-35.

[5] 陳莉敏，李柱來，王津.固定化α-淀粉酶的研究[J].海峽藥學，2006，18(5)：59-61.

[6] LEE Wen-fu，HUANG Chi-tai.Immobilization of trypsin by thermo-responsive hydrogel for the affinity separation of trypsin inhibitor[J].Desalination，2008，234:195-203.