金文育 姚煒民 歐林堅(jiān) 鄭立極

米氏凱倫藻胞內(nèi)多聚磷酸鹽對環(huán)境磷變化的響應(yīng)研究*

金文育1姚煒民1①歐林堅(jiān)2鄭立極3

(1. 國家海洋局溫州海洋環(huán)境監(jiān)測中心站 浙江溫州 325035; 2. 暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心 廣東廣州 510632; 3. 浙江浙能溫州發(fā)電有限公司 浙江樂清 325602)

米氏凱倫藻()赤潮常發(fā)生在磷限制海域, 且能長時(shí)間維持, 可能具有獨(dú)特的胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫利用能力和機(jī)制, 但相關(guān)認(rèn)識(shí)很少。因此, 論文通過研究不同磷濃度對米氏凱倫藻的生長和生理特征的影響, 重點(diǎn)分析了胞內(nèi)多聚磷酸鹽(polyP)對環(huán)境不同磷含量的響應(yīng)變化, 初步闡明胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫對米氏凱倫藻生長和維持的作用。結(jié)果表明, 當(dāng)環(huán)境磷匱乏時(shí), 米氏凱倫藻以0.15 d–1的比生長速率維持生長, 光合活性和生長能力與磷飽和時(shí)無顯著差異, 表明其可適應(yīng)低磷環(huán)境。米氏凱倫藻胞內(nèi)磷庫可支持細(xì)胞分裂近2次。磷脅迫下, 米氏凱倫藻胞內(nèi)polyP被保留, 直到磷限制時(shí)才被利用, 表明polyP不是其優(yōu)先利用且唯一的磷儲(chǔ)庫。研究結(jié)果從營養(yǎng)生理學(xué)角度為磷儲(chǔ)庫在米氏凱倫藻赤潮發(fā)生中的作用提供一定的科學(xué)解釋。

米氏凱倫藻; 磷限制; 顆粒磷; 多聚磷酸鹽

米氏凱倫藻()是世界廣布種, 能夠產(chǎn)生毒素, 無需大量細(xì)胞就可以嚴(yán)重危害當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境。近年來在我國珠江口、閩江口和長江口頻發(fā)赤潮, 給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失, 受到廣泛關(guān)注(郜鈞璋等, 2017; 李曉東, 2018; 呂頌輝等, 2019)。通常認(rèn)為赤潮的暴發(fā)與富營養(yǎng)化有關(guān), 但是米氏凱倫藻赤潮常發(fā)生在潛在的磷限制海區(qū)(Xu, 2008; Liu, 2009), 可見其對于低磷環(huán)境可能有著特殊的適應(yīng)機(jī)制。

目前學(xué)者認(rèn)為浮游植物的低磷適應(yīng)策略, 主要有三個(gè)方面: 提高對外界磷源的吸收水解利用能力(Ou, 2015)、利用胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫(Martin, 2014)和減少細(xì)胞磷需求(Martin, 2011)。已有對米氏凱倫藻耐低磷機(jī)制的研究多集中在對胞外磷源利用方面, 如米氏凱倫藻通過5′-核苷酸酶水解ATP, 吸收利用水解產(chǎn)物磷酸鹽基團(tuán)(Luo, 2017); 直接吸收利用葡萄糖-6-磷酸(Zhang, 2017); 吞噬細(xì)菌和微藻獲得顆粒態(tài)的磷源(Zhang, 2011)。目前, 有關(guān)米氏凱倫藻對胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫利用機(jī)制的研究很少, 無法揭示其對胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫的利用能力和機(jī)制。

多聚磷酸鹽(polyphosphate, polyP)作為胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫的重要組成部分, 由幾個(gè)到上百個(gè)磷酸基團(tuán)經(jīng)高能磷酸酐鍵連接形成的鏈狀無機(jī)化合物, 是細(xì)胞內(nèi)重要的磷酸鹽儲(chǔ)庫, 也是細(xì)胞內(nèi)能量儲(chǔ)庫及ATP來源(Achbergerová, 2011)。在環(huán)境中無機(jī)磷酸鹽基團(tuán)(inorganic phosphate, Pi)充足時(shí), 大多數(shù)浮游植物具有過量吸收Pi的能力, 在滿足細(xì)胞代謝和生長的同時(shí), 將多余的Pi以polyP的形式儲(chǔ)存起來。這部分磷將保證細(xì)胞在低磷時(shí)繼續(xù)維持短時(shí)間的高生長速率(Rao, 2009)。然而浮游植物調(diào)控polyP的機(jī)制并不完全清楚。近年來, 對于polyP的研究大多是大尺度的環(huán)境調(diào)查(Martin, 2014, 2018; Diaz, 2016)。有必要開展更精細(xì)的室內(nèi)研究, 在復(fù)雜的磷變化下, 研究polyP的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。本研究通過分析外界環(huán)境磷濃度變化下米氏凱倫藻的生理生長狀態(tài), 分析細(xì)胞polyP含量變化, 闡明米氏凱倫藻對polyP儲(chǔ)存和利用策略, 以期從磷營養(yǎng)鹽動(dòng)力學(xué)角度為米氏凱倫藻赤潮的發(fā)生提供科學(xué)解釋。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養(yǎng)條件

米氏凱倫藻(No. HK-5)由暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心藻種室提供, 采用人工海水L1培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng), 溫度(20±1) °C, 光照條件為100 μmol/(m2·s),光暗周期為12 h : 12 h。培養(yǎng)期間添加抗生素合劑(氨芐青霉素200 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL和卡那霉素100 μg/mL)抑制細(xì)菌的生長。正式實(shí)驗(yàn)前, 培養(yǎng)藻液經(jīng)5 μg/mL DAPI (Sigma)染色過濾到黑膜上(Millipore), 置于熒光顯微鏡(Olympus, BX61)下用100×鏡觀察計(jì)數(shù), 檢測藻液是否受到細(xì)菌污染。

1.2 不同磷濃度及磷恢復(fù)下對米氏凱倫藻的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

米氏凱倫藻的起始細(xì)胞密度為5.0×103cells/mL, 設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組別: 高磷組(NaH2PO4終濃度為40 μmol/L)和低磷組(NaH2PO4終濃度為5 μmol/L), 每組3個(gè)平行樣。每天檢測細(xì)胞密度、溶解態(tài)無機(jī)磷(dissolved inorganic phosphorus, DIP)含量。選擇在第0、3、4、7和10 d檢測顆粒磷(particulate phosphorus, PP)和polyP含量。待低磷組DIP濃度低于檢出限(0.10 μmol/L) 7 d后, 進(jìn)行磷恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。兩組處理組同時(shí)添加NaH2PO4恢復(fù)DIP含量至～32 μmol/L, 在添加后的0、24和48 h, 檢測細(xì)胞密度、葉綠素(chl)含量、最大光化學(xué)量子效率(vm)、堿性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity, APA)、polyP和PP含量。

1.3 磷酸鹽及生理參數(shù)檢測方法

浮游植物細(xì)胞樣品經(jīng)酸性Lugol’s試劑固定后, 采用100 μL浮游計(jì)數(shù)框在光學(xué)顯微鏡(Olympus CX23, Janpan)下計(jì)數(shù)。微藻培養(yǎng)液經(jīng)離心(2 400, 5 min)收集, 用于polyP測定; 微藻培養(yǎng)液經(jīng)GF/F濾膜(450 °C煅燒2 h)過濾, 濾液和濾膜分別用于DIP和PP測定。采用磷鉬藍(lán)法(Murphy, 1962)檢測DIP、Solórzano等(1980)方法測定PP、Ou等(2015)方法測定APA、丙酮萃取法測定chl含量(Jespersen, 1987), 以及Phyto-PAM法測定光化學(xué)效率vm。PolyP樣品通過離心(2 400, 5 min)方法收集。測定方法參照Martin等(2013) DAPI熒光定量法: 收集的藻細(xì)胞超聲破碎細(xì)胞后, 添加DNA酶、RNA酶和蛋白酶K, 重復(fù)萃取3～4次; 取500 μL萃取液加入60 μL 100μmol/L DAPI溶液, 黑暗染色7 min, 搖勻定容至1.5 mL, 采用熒光分光光度計(jì)(HITACHI, F-4600)在Ex: 415 nm和Em: 550 nm條件下檢測。

1.4 polyP凈產(chǎn)生速率計(jì)算及數(shù)據(jù)分析

參考Anderson等(1990)毒素凈產(chǎn)生速率的計(jì)算公式計(jì)算polyP凈產(chǎn)生速率, 如下:

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 14作圖, 采用One-way ANOVA(Turkey test)分析顯著性水平(<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 米氏凱倫藻的生長和生理活性

高磷組和低磷組DIP濃度均隨時(shí)間逐漸下降, 從第4 d起低磷組DIP濃度低于檢出限, 而高磷組至第10 d DIP濃度為(8.02±0.64) μmol/L; 在第11 d重新添加NaH2PO4, 恢復(fù)DIP含量至～32 μmol/L, 添加后低磷組DIP被快速消耗, 至第13 d DIP濃度再次低于檢出限(圖1a)。低磷組細(xì)胞生長與高磷組無顯著差異(>0.05), 均以0.15 d–1生長速率生長, 細(xì)胞密度從(5.17±0.26)×103cells/mL增至(2.22±0.14)×104cells/mL, 約增長4.29倍(圖1b); 在磷恢復(fù)階段, 低磷組米氏凱倫藻以0.12 d–1生長速率持續(xù)生長, 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最大細(xì)胞密度(4.64±0.26)×104cells/mL, 而高磷組在第12 d進(jìn)入穩(wěn)定期, 最大細(xì)胞密度到達(dá)(3.68±0.12)×104cells/mL, 高、低磷組最大細(xì)胞密度無顯著差異(>0.05)。

在長時(shí)間的磷饑餓后, 低磷組第11 d檢測到APA為(208.58±27.56) fmol/(cell·h), 約為高磷組的25倍(<0.05, 圖2a); 加磷恢復(fù)后, 低磷組APA迅速降至(73.04±10.67) fmol/(cell·h), 但仍顯著高于高磷組(<0.05)。磷恢復(fù)當(dāng)天和之后兩天, 兩組間的單位細(xì)胞chl含量及vm無顯著性差異(>0.05, 圖2b, 2c)。

2.2 米氏凱倫藻細(xì)胞PP和polyP含量

第1 d, 高磷組細(xì)胞PP含量顯著上升至(2.13±0.13) pmol/cell, 維持在1.84～1.97 pmol/cell至第11 d (圖3); 加磷恢復(fù)后, 小幅下降至1.41～ 1.64 pmol/cell。第1 d, 低磷組細(xì)胞PP含量達(dá)到最大(1.63±0.06) pmol/cell, 之后持續(xù)下降至(0.42±0.08) pmol/cell; 這個(gè)過程中低磷組細(xì)胞PP顯著低于高磷組(<0.05), 最大差別可達(dá)3.88倍。添加NaH2PO4后24 h即第12 d, 低磷組單位細(xì)胞PP含量恢復(fù)至高磷組水平(<0.05), 第13 d又開始下降, 與高磷組有顯著差異(<0.05)。

圖1 培養(yǎng)基中溶解態(tài)無機(jī)磷酸鹽濃度(DIP, a)和米氏凱倫藻細(xì)胞密度(b)變化

注: 箭頭表示加磷恢復(fù)

圖2 米氏凱倫藻堿性磷酸酶活性(a)、葉綠素a含量(b)、光化學(xué)效率Fv/Fm(c)的變化

注: a, b表示同一時(shí)間組別間存在顯著差異,<0.05

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 高磷組和低磷組的米氏凱倫藻單位細(xì)胞polyP含量均呈現(xiàn)下降、上升再下降的變化趨勢, 兩組之間沒有顯著差異(>0.05, 圖4a)。但低磷組polyP : PP比值在DIP耗盡時(shí)(第4 d)開始高于高磷組, 約為高磷組的2.9～3.3倍(<0.05)至第11 d磷恢復(fù)前。加磷恢復(fù)后, 低磷組polyP : PP比值因PP上升而回落, 與高磷組無差異(>0.05, 圖4b)。對比不同磷濃度下polyP凈產(chǎn)生率, 發(fā)現(xiàn)環(huán)境磷酸鹽富余時(shí)米氏凱倫藻合成polyP。第3 d高磷組polyP凈產(chǎn)生率到達(dá)(8.57±1.14)×10–7neq/(cell·d), 隨后迅速下降達(dá)到穩(wěn)態(tài); 而低磷組在第3和4 d維持較高凈產(chǎn)生率, 最大值為(3.85±2.93)×10–7neq/(cell·d), 第7 d達(dá)到穩(wěn)態(tài), 第11 d時(shí)再次發(fā)生下降(圖4c)。

圖3 米氏凱倫藻單位細(xì)胞顆粒磷含量變化

注: 箭頭表示加磷恢復(fù)時(shí)間, a, b表示組別間存在顯著差異,<0.05

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻有較強(qiáng)的耐磷特性。在環(huán)境中DIP耗盡(<0.12 μmol/L)后的7 d內(nèi), 仍以0.15 d–1生長速率維持生長, 細(xì)胞密度增長4.29倍, 其生物量及v/m與同時(shí)期高磷組無顯著差異, 同時(shí), 缺磷條件下, 米氏凱倫藻單位細(xì)胞PP含量逐漸下降, 不斷接近最低閾值, 為米氏凱倫藻細(xì)胞最低磷需求, 高低磷組間PP含量最大差別可達(dá)3.88倍, 表明米氏凱倫藻在DIP不足時(shí)能夠立刻轉(zhuǎn)向利用胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫來維持生長, 滿足細(xì)胞分裂將近2次, 同時(shí)光合速率不受影響。該結(jié)果與馮青靚(2021)研究一致。而在磷補(bǔ)充后, 經(jīng)過一段時(shí)間磷脅迫下的米氏凱倫藻從環(huán)境中快速獲取DIP, 單位細(xì)胞PP含量迅速恢復(fù)至磷飽和水平, 這表明在外界波動(dòng)的磷環(huán)境條件下, 米氏凱倫藻的胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫有具有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖4 米氏凱倫藻胞內(nèi)多聚磷酸鹽(polyP)含量(a)、多聚磷酸鹽與顆粒磷比例(polyP : PP)(b)及多磷酸鹽凈產(chǎn)生率(RpolyP)(c)變化

PP作為浮游植物總磷儲(chǔ)庫概念, 包括細(xì)胞內(nèi)絕大部分磷組分, 能夠在磷匱乏時(shí)提供磷源(Karl, 2014)。本研究中, PP能夠支持米氏凱倫藻至少7 d的生長, 該結(jié)果與黃銀爽(2018)和馮青靚(2021)研究相近, 兩者結(jié)果均顯示PP能夠滿足米氏凱倫藻5 d生長。若將胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫細(xì)分, 一般認(rèn)為浮游植物中有4種重要的磷儲(chǔ)庫: polyP、磷脂、核酸和胞內(nèi)DIP (Karl, 2014)。其中, polyP作為重要的胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫, 廣泛存在于原核和真核細(xì)胞中(Kulaev, 2004)。在外界環(huán)境營養(yǎng)充足的情況下, 浮游植物會(huì)過量攝取Pi, 滿足自身生長分裂需求后, 將多余的磷以polyP形式儲(chǔ)存(Rao, 2009)。此外, polyP也是能量儲(chǔ)庫, 是ATP的主要來源(Achbergerová, 2011)。本次實(shí)驗(yàn)米氏凱倫藻中檢測到polyP含量約4×10–5neq/cell, 第4 d后單位細(xì)胞polyP含量逐漸下降, 即使磷恢復(fù)也無明顯增加。推測磷恢復(fù)后, 米氏凱倫藻細(xì)胞分裂加快, 稀釋細(xì)胞polyP含量增加, 掩蓋了其變化趨勢。

細(xì)胞polyP凈產(chǎn)生率較細(xì)胞polyP含量更好地反映細(xì)胞內(nèi)polyP合成與利用。通過polyP凈產(chǎn)生率結(jié)果發(fā)現(xiàn), 米氏凱倫藻可能通過利用胞內(nèi)polyP度過適應(yīng)階段, 隨后吸收DIP合成polyP以補(bǔ)充消耗及儲(chǔ)存, 即磷的過量吸收(luxury uptake, Elizabeth, 2010)。磷飽和狀態(tài)下, 米氏凱倫藻先達(dá)到穩(wěn)態(tài), polyP凈產(chǎn)生率0.33×10–7neq/(cell·d), polyP合成與利用達(dá)到平衡。磷脅迫狀態(tài)下, 米氏凱倫藻前期維持相對較高polyP凈產(chǎn)生率[4.72×10–7neq/(cell·d)], 以充分利用外界的磷酸鹽, 直至環(huán)境中磷耗盡, 合成過程終止。此時(shí)polyP : PP比值上升, 這與Martin等(2014)的研究結(jié)果一致。若浮游植物受到磷脅迫時(shí)主要?jiǎng)佑胮olyP儲(chǔ)庫來維持生長, polyP : PP應(yīng)下降, 相較于傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為胞內(nèi)polyP是浮游植物在磷脅迫下利用的最重要的胞內(nèi)磷庫, 可見polyP不是米氏凱倫藻優(yōu)先利用且唯一的磷儲(chǔ)庫。這可能與細(xì)胞大小有關(guān), polyP相比Pi所需的空間要小(聚集形成顆粒), 小細(xì)胞的浮游植物更加需要累積polyP做為磷儲(chǔ)庫(Raven, 2010)。因此polyP對大細(xì)胞的米氏凱倫藻可能不是首選, 只有達(dá)到極度磷限制時(shí)才被利用[polyP的凈產(chǎn)生率為-1.98×10–7neq/(cell·d)]。在實(shí)驗(yàn)后期的磷補(bǔ)充恢復(fù)階段, 極度磷限制的米氏凱倫藻吸收大量DIP, 此時(shí)polyP凈產(chǎn)生率為-0.76×10–7neq/(cell·d), 未出現(xiàn)過剩反應(yīng)(overplus response, 即磷脅迫下因另補(bǔ)充Pi出現(xiàn)polyP累積現(xiàn)象(Elizabeth, 2010)), 表明吸收入細(xì)胞內(nèi)的磷并未用于合成polyP, 而是優(yōu)先補(bǔ)充其他磷儲(chǔ)庫。如甘油磷脂是細(xì)胞膜的基本組成部分, 占細(xì)胞總磷10%～20%, 在營養(yǎng)限制條件下是一個(gè)可被利用潛在的磷庫(Liang, 2019)。假威海鏈藻()添加磷恢復(fù)后能夠快速將非磷脂轉(zhuǎn)換回磷脂(Martin, 2011)。米氏凱倫藻也可能存在這種能力, 隨后將富余的磷酸鹽逐漸合成polyP。

4 結(jié)論

米氏凱倫藻有較強(qiáng)的耐磷特性能, 利用胞內(nèi)磷儲(chǔ)庫應(yīng)對低磷環(huán)境, 維持生長速率并保持生理活性。PP能夠支持米氏凱倫藻至少7 d, 比生長速率0.15 d–1的生長, 可以滿足細(xì)胞分裂將近2次, 同時(shí)光合速率不受影響。一旦磷恢復(fù), 米氏凱倫藻會(huì)迅速吸收DIP補(bǔ)充自身PP消耗。磷脅迫狀態(tài)下米氏凱倫藻polyP : PP比值上升, 可見polyP不是米氏凱倫藻優(yōu)先利用且唯一的磷儲(chǔ)庫, 相較于傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為胞內(nèi)polyP是浮游植物在磷脅迫下利用的最重要的胞內(nèi)磷庫, 米氏凱倫藻對胞內(nèi)磷資源的分配利用上可能存在其他更為經(jīng)濟(jì)、高效的通路, 值得進(jìn)一步研究。

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RESPONSE OF INTRACELLULAR POLYPHOSPHATE INTO THE VARIATION OF PHOSPHORUS IN THE ENVIRONMENT

JIN Wen-Yu1, YAO Wei-Min1, OU Lin-Jian2, ZHENG Li-Ji3

(1. Wenzhou Marine Environmental Monitoring Center Station, Wenzhou 325035, China; 2. Research Center of Harmful Algae and Marine Biology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 3. Zhejiang Zheneng Wenzhou Power Co., Ltd., Yueqing 325602, China)

blooms often occur in phosphorus (P)-limited sea areas and can last for a long time under P deficiency. To classify the major role of P pool during blooms, the growth and the physiological response of intracellular P pool, especially polyphosphate, inwere examined under different P conditions.could sustain growth at a growth rate of 0.15 d–1under P depleted environment and its photosynthetic activity and growth capability showed no difference with those in P-replete conditions, showing the ability of acclimation ofto P deficiency. The particulate phosphorus content in the intracellular P pool could support cells to divide almost twice. Under a low-phosphate condition, intracellular polyphosphate was synthesized adequately, and did not decrease until cell growth was suppressed under P-limited condition, suggesting that polyphosphate was not a preferred utilized intracellular P pool nor the unique P pool. This study provided an insight for understanding P regulation induring its bloom from the perspective of nutritional physiology.

; P-limitation; particulate phosphorus; polyphosphate

*國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃, 2017YFC1404300號(hào); 國家自然科學(xué)基金, 41776121號(hào)。金文育, 碩士研究生, E-mail: jinwenyu@ stu2016.jnu.edu.cn

姚煒民, 高級(jí)工程師, E-mail: ywm@ecs.mnr.gov.cn

2021-06-19,

2021-09-30

X173

10.11693/hyhz20210600140