陳 玉，李 杏，張海平，Gábor Vajta，陳文彬，劉 杰，李 林，杜玉濤

(1.深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518083；2.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083)

眾所周知，1997年首次獲得的體細(xì)胞克隆綿羊[1]是在顯微操作儀器輔助下，通過顯微操作技術(shù)(傳統(tǒng)克隆)把供體核移入去除遺傳物質(zhì)的成熟卵母細(xì)胞中，新移入的細(xì)胞核，發(fā)生發(fā)育重編程過程，形成重構(gòu)胚。在獲得克隆綿羊之后，黃牛、水牛、山羊、騾子、馬、豬、小鼠、大鼠、兔子、貓、狗等多種克隆動物均通過顯微操作技術(shù)相繼問世[2]。

2004年，Vajta等人，利用手工克隆方法成功獲得了克隆牛[3]。此方法是在體視顯微鏡下，手持特制刀片將無透明帶卵母細(xì)胞的核切除，從而達(dá)到去核目的。手工克隆與傳統(tǒng)克隆相比，無需使用顯微操作儀，僅使用較簡單的儀器設(shè)備和技術(shù)要求即可生產(chǎn)克隆動物。至今，通過手工克隆技術(shù)，已經(jīng)生產(chǎn)出了豬[4]、基因豬[5]、轉(zhuǎn)基因綿羊[6]等哺乳動物。

小鼠由于具有遺傳背景清楚，繁殖周期短，飼養(yǎng)成本較低，材料比較容易得到等優(yōu)點，成為一種廣泛使用的模式實驗動物[7，8]。第一只成纖維細(xì)胞克隆小鼠，由Wakayama等人在1998年獲得[9]。研究人員通過顯微操作直接將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞，成功得到了來自顆粒細(xì)胞作為供體核的正常后代，以及支持細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞作為供體核的正常胎兒[9]。Atsuo Ogura等人，通過電融合法，將供體細(xì)胞核注入卵周隙，加以一定強度電脈沖，使供體細(xì)胞核與去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)產(chǎn)生融合，成功獲得小鼠尾尖細(xì)胞克隆小鼠[9]。R.Ribas等人，在2005年發(fā)表的文章中，闡述了以鈍頭去核針和頂端封閉的分離管結(jié)合使用，去除無透明帶卵母細(xì)胞細(xì)胞核，經(jīng)電融合構(gòu)建重構(gòu)胚，繼而獲得克隆小鼠的實驗[10]。

研究人員通過對卵母細(xì)胞透明帶消化試劑、電激活參數(shù)、化學(xué)激活時間，以及培養(yǎng)試劑的研究，初步建立了一套適合本實驗室運用的手工克隆技術(shù)及在體外條件下生產(chǎn)小鼠胚胎的實驗流程，為轉(zhuǎn)基因、胚胎干細(xì)胞、模式動物克隆等研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 試劑

孕馬血清促性腺激素(PMSG)，人絨毛膜促性腺激素(hCG)購自寧波制藥二廠。其余試劑購自Sigma公司。

1.2 實驗動物

KM品系鼠，C57品系鼠和CF-1品系鼠均采購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.3 溶液配制

卵子采集液：M2，參考[11]配制。

去核液：為含有5 μg/mL細(xì)胞松弛素和10 μg/mL，20 μg/mL，或100 μg/mL鏈蛋白酶(pronase)的M2，即CBMP。

電融合液：PFM，參考[4]配制。

化學(xué)激活液：含5 mmol/L或10 mmol/L氯化鍶(SrCl2)和5 μg/mL CB的無鈣CZB液體。

培養(yǎng)液：CZB，配制參考[11]。mPZM，配制參考[12]。

體細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞消化液：商品化高糖DMEM液加入1%谷氨酰胺(GLU)，非必需氨基酸(NEAA)，15%胎牛血清(FBS)配制成完全DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。商品化PBS粉末配制D-PBS。商品化0.05%胰蛋白酶(Trypsin)。

1.4 卵母細(xì)胞采集

室溫條件下，7～8周齡的KM雌鼠，每只空腹腔注射10IU的PMSG，48 h后腹腔注射10IU hCG。在注射hCG 13 h后，采用斷頸椎法處死小鼠，并且剪下輸卵管連接卵巢段，轉(zhuǎn)移至顯微鏡下，挑破輸卵管膨大部，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。將COCs放入含有透明質(zhì)酸酶(Hya)的M2滴中，卵丘細(xì)胞脫落后的卵母細(xì)胞在M2中洗滌3遍，轉(zhuǎn)移至切割盤里的M2滴中。

1.5 核供體細(xì)胞準(zhǔn)備

核供體細(xì)胞系來自12.5 d的CF-C胎鼠，由CF-1♂與C57♀雜交得到，來自本實驗室。在進(jìn)行克隆實驗之前1 h，選擇24孔板中培養(yǎng)核供體細(xì)胞生長至匯合率達(dá)90%培養(yǎng)孔，用0.05%胰蛋白酶(Trysin)消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化，移液器輕微吹打后，液體轉(zhuǎn)移到EP管中。

1.6 卵母細(xì)胞去核

用口吸管將切割盤里M2滴中卵母細(xì)胞一次轉(zhuǎn)移10～15枚至20μL CBMP滴中，觀察透明胞質(zhì)中細(xì)胞核的位置，待透明帶變薄變軟時，用特殊HMC刀片將含有核的胞質(zhì)部分切除，轉(zhuǎn)移去核后細(xì)胞質(zhì)到M2滴中存放。循環(huán)此動作至所有卵母細(xì)胞全部完成去核。

1.7 電融合過程

打開融合儀(BLS CF-150/B)，調(diào)節(jié)電壓及脈沖間隔。設(shè)計三組參數(shù)，Ⅰ為DC 130 V，83 μs；Ⅱ為DC 43 V，80 μs；Ⅲ為DC 80 V，40 μs。在融合盤中，將一枚去核胞質(zhì)與一枚核供體細(xì)胞用植物凝集素(PHA)粘合后，置于PFM液滴中平衡，與另一枚去核胞質(zhì)配對，再移入盛有融合液的融合槽電極之間(電極之間寬650 μm)，用玻璃針輕撥，通過電流作用使重構(gòu)體(去核胞質(zhì)-核供體細(xì)胞-去核胞質(zhì))方向和電流方向垂直，最后開啟電擊。一次電擊5套重構(gòu)體，循環(huán)操作至所有配對重構(gòu)體電融合完成。電擊后，用玻璃針輕柔取下重構(gòu)體，移入M2滴中。將融合后的重構(gòu)胚置于CZB液中，于CO2培養(yǎng)箱，37 ℃中放置1 h。

1.8 化學(xué)激活

從培養(yǎng)箱中取出重構(gòu)胚，在無鈣離子CZB液中清洗3遍，移入含有Srcl2(5 mmol/L或10 mmol/L)及CB(5 μg/mL)的化學(xué)激活孔中，置于CO2培養(yǎng)箱，37 ℃，放置6 h。

1.9 重構(gòu)胚培養(yǎng)

重構(gòu)胚無透明帶，故采用WOW培養(yǎng)系統(tǒng)。將化學(xué)激活后的重構(gòu)胚，在CZB液中清洗3遍，逐個移入盛有CZB或mPZM的WOW孔中，置于CO2培養(yǎng)箱，37 ℃，培養(yǎng)至第4天，可觀察囊胚發(fā)育情況。

1.10 統(tǒng)計分析

所有試驗組至少重復(fù)3次，所得試驗數(shù)據(jù)均用方差分析統(tǒng)計，確定差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 去核液中Pronase濃度對消化透明帶時間的影響

統(tǒng)一脫去卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，15個卵母細(xì)胞為一組，放入含不同Pronase濃度的CBMP液滴中消化透明帶并進(jìn)行去核。由表1可見，三個濃度組別間差異顯著。10 μg/mL組相比其它兩個濃度組，卵母細(xì)胞可在10 μg/mL組液滴中存放更長時間(2.73±0.06 min)透明帶才會完全消失，方便實驗人員去核操作。在以后實驗中，CBMP均采用10 μg/mL Pronase濃度配制。

表1 不同Pronase濃度消化透明帶時間比較

注：同一列表中上標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，下表同。

2.2 不同電融合參數(shù)對融合率的影響

實驗采用3組電融合參數(shù)對用PHA粘合后的重構(gòu)體進(jìn)行電融合，結(jié)果如表2所示，只有Ⅲ(DC 80 V，40 μs)出現(xiàn)了融合，其余兩組重構(gòu)體在電擊時或是電擊后細(xì)胞質(zhì)彌散，死亡。故電融合時，電融合儀器設(shè)置為DC 80 V，40 μs。

表2 不同電融合參數(shù)比較

2.3 不同氯化鍶濃度的化學(xué)激活液對激活效果的影響

實驗對添加兩種不同濃度氯化鍶的化學(xué)激活液進(jìn)行了比較，結(jié)果可見表3，兩組間差異顯著。經(jīng)過添加10 mmol/L Srcl2的激活液處理的重構(gòu)胚，可以得到更多的囊胚。

表3 不同氯化鍶濃度對激活效果的比較

2.4 不同培養(yǎng)液對胚胎發(fā)育的影響

在其他操作相同的情況下，比較了兩種培養(yǎng)液對小鼠HMC重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響。結(jié)果如表4所示，兩者在IVC囊胚率上無顯著差異(P>0.05)。平均囊胚率顯示，CZB作為IVC培養(yǎng)液可獲得比較高的囊胚率，故實驗選用CZB作為IVC液。

表4 不同培養(yǎng)液對胚胎發(fā)育的比較

3 討論

傳統(tǒng)克隆均用顯微操作儀完成，本實驗室首次采用HMC方法進(jìn)行小鼠克隆胚胎生產(chǎn)。結(jié)合透明帶消化、電激活參數(shù)設(shè)置、化學(xué)激活試劑濃度及培養(yǎng)液的選擇，對小鼠HMC進(jìn)行了嘗試，摸索了小鼠體外生產(chǎn)克隆胚胎的新方法，并取得了初步的成果。

Pronase具有消化卵母細(xì)胞透明帶的作用，研究人員參考牛和豬HMC[3，4]中去核液Pronase添加濃度，設(shè)計了本實驗中Pronase濃度，并創(chuàng)新性地將Pronase與CB結(jié)合配制出CBMP，作為去核液。此消化液使得卵母細(xì)胞在透明帶被消化的同時，細(xì)胞質(zhì)疏松，易于切割去核，避免了單獨用Pronase消化造成透明帶消化過度，卵母細(xì)胞去核存活率低的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，使用10 μg/mL Pronase濃度的CBMP，可以讓研究人員有充足的時間在15枚卵母細(xì)胞透明帶未完全消化之前完成去核。

融合是體細(xì)胞核移植中的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞融合起源于膜的融合，膜的融合最初發(fā)生在兩個細(xì)胞接觸的部位，并逐漸擴大至完全融合為一個細(xì)胞[13]。R.RIBAS等，使用250 μm寬的融合槽，2.00 KV/cm，2×16 μs的參數(shù)融合無透明帶卵母細(xì)胞與體細(xì)胞[10]取得了比較好的效果。但此參數(shù)對于本實驗室操作不適用，而豬HMC中電融合參數(shù)也不能取得好的效果，在電擊一瞬間，兩枚胞質(zhì)渙散死亡，或在從融合槽取出重構(gòu)體后，在M2滴中死亡。使用DC 80 V，40 μs作為電擊參數(shù)，可以取得60%平均融合率，在往后實驗中需要進(jìn)一步優(yōu)化融合步驟及參數(shù)。

化學(xué)激活亦是核移植中不可缺少的步驟。本實驗對比了在無鈣離子CZB中添加CB及不同濃度氯化鍶作為激活液，結(jié)果表明使用10 mmol/L氯化鍶的激活效果優(yōu)于5 mmol/L的濃度，此結(jié)果與R.RIBAS等[10]的結(jié)論一致。

小鼠胚胎操作實驗手冊[11]中介紹了CZB作為小鼠IVC培養(yǎng)液的配方，而在DasariAmarnath等發(fā)表的文章中，介紹了mPZM作為培養(yǎng)液IVC小鼠胚胎的效果[12]。本實驗結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)液對小鼠HMC重構(gòu)胚IVC效果無顯著差異，從平均囊胚率上比較，CZB(29±3%)略優(yōu)于mPZM(24±5%)。

綜上所述，本實驗室使用M2配制的含5 μg/mL CB和10 μg/mL Pronase的CBMP作為去核液，650 μm融合槽，PFM作為融合液，DC 80 V，40 μs電融合，融合后放置1 h，無鈣離子CZB含10 mmol/L Srcl2與5 μg/mL CB作為激活液，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃激活6 h后，CZB作為IVC液，WOW系統(tǒng)培養(yǎng)，這一系列的操作后，可獲得通過HMC方法體外生產(chǎn)小鼠胚胎。

目前，小鼠克隆效率仍然很低，在理論和技術(shù)上都還不成熟，對胚胎發(fā)育機制及調(diào)控還需要進(jìn)一步的研究。我們相信，隨著對哺乳動物細(xì)胞核移植研究的不斷增多和深入，核移植各個環(huán)節(jié)的效率均會有所提高。小鼠HMC也將進(jìn)行更進(jìn)一步的優(yōu)化和完善。

[1] Wilmutt，Schnieke A E，Mcwhir J，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature，1997，385：810-813.

[2] C Palmieri，P Loi，G Ptak，et al.Review paper：A review of the pathology of abnormal placentae of somatic cell nuclear transfer clone pregnancies in cattle，sheep，and mice [J].Veterinary Pathology Online，2012，865-880.

[3] Vajta G，Bartels P，Joubert J，et al.Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulatiors and carbon dioxide incubators using the Handmade Cloning(HMC)and the Submarine Incubation System(SIS).Theriogenology，2004，Nov；62(8)，1465-72.

[4] Du Y，Kraqh PM，Zhang Y，et al.Piglets born from handmade cloning，an innovative cloning method without micromanipulation[J].Theriogenology，2007，Nov；68(8)，1104-10.

[5] Zhang P，Zhang Y，Dou H，et al.Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene[J].Cell Reprogram，2012，Jun，14(3)，258-66.

[6] Zhang P，Liu P，Dou H，et al.Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 Fatty acids[J].PLoS One，2013，8(2).

[7] 郭淑華.小鼠體細(xì)胞核移植研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008，36(28)，12279-12281.

[8] 王怡.小鼠體細(xì)胞核移植研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2009，36(3)，97-101.

[9] Atsuo Ogura，Kimiko Inoue，Kaoru Takano，et al.Birth of Mice After Nuclear Transfer by Electrofusion Using Tail Tip Cells[J].Molecular Reproduction and Development，2000，57：55-59.

[10] R Ribas，Oback，W Ritchie，et al.Development of a Zona-Free Method of Nuclear Transfer in the Mouse[J].Cloning and Stem Cells，2005，7：126-138.

[11] 孫青原，陳大元 主譯.小鼠胚胎操作實驗手冊[M].第三版，2005，9.

[12] DasariAmarnath，Sayaka Wakayama，Jie Zhu，et al.The novel use of modified pig zygotic medium for the efficient culture of the preimplantation mouse embryos.Theriogenology，2011，1639-1646.

[13] 王怡，鞠輝明，薛整風(fēng)，等.融合條件對小鼠體細(xì)胞核移植融合率的影響[J].實驗動物與比較醫(yī)學(xué)，2009，29(6)，366-371.

Abstract：Compared with the traditional cloning，cloned animals could be made by more simple equipments and technical operations，and that procedure is handmade cloning(HMC).

As model animals，mouse are applied in many fields.In the present study，nuclear donor came from hybrided fetal cell lines；zona pellucida digestion and enucleating happed in droplets of Cytochalasin B(CB)and Pronase and 2% serum M199hepes buffer(CBMP)；1hour after electric fusion，the reconstructed embryos were set into Ca2+-free activation medium containing SrCl2and CB(5 mu g/mL)for the next 6 hours；finally，the embryos were culture to blastocyst stages in a WOW system with culture medium(IVC).The results show that：Firstly，compared with 20μg/mL and 100μg/mL，CBMP with 10μg/mL pronase was suitable for operation due to zona pellucid had sufficient time for digestion while enucleating.Secondly，80v DC，with 40μs endurance time，the fusion rate achieved 60%.Third，chemical activation with10mM SrCl2significantly increased the blastocyst rate compared with 5mM(29±3% vs 13±3%，P<0.05).Fourthly，a comparison between CZB and mPZM，there was no significant difference in blastocyst rate(29±3% vs 24±5%，P>0.05)，but more blastocysts could be obtained when embryos cultured in CZB.

After investigate the digestion time，fusion parameters，chemical activation and culture mediums，a novel HMC procedure for cloned embryos of mouse is established for the first time，although the technical optimization and higher efficiency are required further research.

Keywords：mouse；HMC；zona pellucida digestion；electric fusion；chemical activation；in vitro culture