， ，，

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室，神經(jīng)生物學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院骨科，重慶 400037；3.解放軍77100部隊(duì)后勤部門診部，重慶 400014)

中樞神經(jīng)損傷后難以再生[1]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身特點(diǎn)及損傷后局部微環(huán)境是造成脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后再生困難的主要因素[2]。而周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)損傷后可以再生，受損軸突和髓鞘碎片的及時(shí)清除為軸突再生提供通道。但是，CNS損傷后這個(gè)清除過程卻被延遲，CNS中有吞噬和免疫功能的小膠質(zhì)細(xì)胞以及損傷后浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞沒有能夠及時(shí)清除碎片，使損傷軸突的周圍環(huán)境不利于再生。因此，在CNS損傷的急性期及時(shí)創(chuàng)造利于再生的環(huán)境對(duì)促進(jìn)CNS損傷修復(fù)是非常必要的。脊髓損傷急性期，小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參與的炎性反應(yīng)是主要的病理表現(xiàn)之一[3]。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)作為固有免疫的組成部分[4]，在壓迫性脊髓損傷急性期表達(dá)明顯上調(diào)[5]，但其上調(diào)的意義目前還不完全清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，脊髓半橫斷損傷后與軸突再生相關(guān)的Ras同族基因家族成員A(Ras homolog gene family member A，RhoA)表達(dá)上調(diào)，可能與軸突再生受阻有關(guān)。本研究旨在探討重物墜落所致脊髓損傷急性期MIF參與脊髓損傷及修復(fù)過程的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量20～25 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。脊髓砸傷裝置一套(固定架、套管、重錘、擊打錘)。主要試劑：抗體anti-MIF和anti-OX42購(gòu)自Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉公司，Simply P總RNA提取試劑盒購(gòu)自BioFLux公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自BioRT公司。

1.2 小鼠脊髓砸傷模型

將30只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組及手術(shù)組，腹腔注射4%水合氯醛麻醉，皮膚消毒后，縱行切開背部皮膚及皮下組織，鈍性分離椎旁肌肉組織，切除T10棘突及椎板暴露硬脊膜，固定擊打錘使之輕觸脊髓表面，擊打錘接觸脊髓面為半徑1 mm的圓形，使用砸傷裝置將10 g重錘固定于5 cm高度，自由落下撞擊擊打錘砸傷T9～T10脊髓組織[6]。砸傷瞬間動(dòng)物痙攣性擺尾并出現(xiàn)雙下肢回縮后癱瘓，視為造模成功。假手術(shù)對(duì)照組僅切除T9～T10棘突及椎板，不進(jìn)行砸傷。術(shù)后保暖至動(dòng)物從麻醉中蘇醒，正常喂養(yǎng)，每日1次腹腔注射青霉素2萬(wàn)單位，人工膀胱按壓擠尿3次。根據(jù)BBB評(píng)分方法[6]分別于術(shù)后24 h和72 h，由與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)人員進(jìn)行小鼠下肢功能評(píng)價(jià)。

1.3 損傷脊髓免疫組織化學(xué)染色

分別于術(shù)后24 h和72 h兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉小鼠，37 ℃生理鹽水及預(yù)冷4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注。取小鼠脊髓損傷段脊髓組織，經(jīng)后固定、脫水后常規(guī)冰凍切片，厚度15 μm。切片PBS漂洗每次5 min，共3次；5%正常山羊血清37 ℃封閉1 h；加入一抗(anti-MIF，1︰200)37 ℃放置1 h后，4 ℃過夜；取出后，PBS漂洗3次，每次5 min；HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min；用DAB顯色試劑盒對(duì)切片進(jìn)行顯色普通光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。

1.4 小膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)

使用5 d以內(nèi)新生小鼠，75%乙醇浸泡消毒后迅速斷頭，于預(yù)冷的D-Hanks平衡液中仔細(xì)剝離腦膜并分離皮層；剪碎并漂洗組織后，0.125%胰酶37 ℃中消化30 min，10%胎牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS-DMEM/F12-1%P/S培養(yǎng)基重懸浮細(xì)胞，輕微吹打至細(xì)胞懸浮，200目細(xì)胞篩過濾，種植于培養(yǎng)瓶中，12～24 h完成首次換液，以后每3 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至第14天，取出細(xì)胞并于眶式搖床上篩選細(xì)胞，200 r/min，2 h后，收集上清，1 000 r/min離心10 min，種植于24孔板中，密度3.5×105/cm2，37 ℃，5%CO2孵箱中備用[8]。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)染色

取出細(xì)胞爬片，室溫下，使用37 ℃預(yù)熱的4%多聚甲醛液固定細(xì)胞30 min，PBS漂洗；5%正常山羊血清封閉，37 ℃，1 h；加入一抗混合液(使用一抗稀釋液稀釋OX42、MIF、MBP，濃度1︰100、1︰200)，4 ℃過夜；PBS漂洗；37 ℃孵育二抗(Rho標(biāo)記的羊抗兔二抗)，避光；PBS漂洗，加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，37 ℃避光1 h；棄二抗，DAPI復(fù)染，室溫30 min，PBS漂洗；抗熒光淬滅封片劑避光封片，拍照。全過程中，PBS漂洗均為每次5 min，均為3次。

1.6 RT-PCR檢測(cè)損傷脊髓MIF和RhoA mRNA表達(dá)

提取損傷組織總RNA，檢測(cè)A260、A280，計(jì)算RNA濃度及A260/A280，A260/A280比值在1.8～2.0范圍內(nèi)的RNA純度合格。PCR擴(kuò)增引物: Nogo-A基因上游：5’-CTGGAGTGGTGTATTTTGGTGC-3’，下游：5’-TACTGTTTGGGGCCTTGTCATT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度550 bp；MIF基因上游：5’-TTTGCAGGGAGGACACAGGAA-3’，下游：5’-TGGCAGCGTTCATGTCGTAATA-3’， 產(chǎn)物長(zhǎng)度551 bp；RhoA基因上游：5’-TGTCAACTGCAAGAACTCTGGT-3’，下游：5’-AAGGAGCACTGTGACTTAGAGC-3’， 產(chǎn)物長(zhǎng)度608 bp；β-actin基因上游：5’-ACGTTGACATCCGTAAAGACCT-3’，下游：5’-CAGTAACAGTCCGCCTAGAAGC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度286 bp。將PCR產(chǎn)物放入1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80 V，60 min)，應(yīng)用凝膠電泳成像儀觀察并通過Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠脊髓損傷后MIF的表達(dá)增加

假手術(shù)組小鼠脊髓白質(zhì)中可見MIF陽(yáng)性的軸突均勻分布，白質(zhì)中也存在膠質(zhì)細(xì)胞樣的陽(yáng)性細(xì)胞?；屹|(zhì)中以及神經(jīng)元表達(dá)的MIF水平較低。脊髓損傷72 h后，白質(zhì)中可見膨大的軸突末端呈MIF強(qiáng)陽(yáng)性。灰質(zhì)和白質(zhì)中可見MIF強(qiáng)陽(yáng)性的阿米巴樣細(xì)胞，灰質(zhì)中MIF表達(dá)增強(qiáng)(圖1)。從脊髓橫切片上可見，假手術(shù)組動(dòng)物白質(zhì)和灰質(zhì)中均有MIF的低水平表達(dá)，脊髓損傷72 h后，MIF表達(dá)顯著上調(diào)，尤其在白質(zhì)中有大量MIF陽(yáng)性的細(xì)胞及軸突終末，MIF陽(yáng)性細(xì)胞從形態(tài)上看與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞相似，灰質(zhì)中神經(jīng)元中MIF表達(dá)改變不明顯(圖2)。

a：假手術(shù)組(×200，標(biāo)尺=50 μm)；b：a的局部放大(×400，標(biāo)尺=20 μm)；c：SCI后72 h組(×200，標(biāo)尺=50 μm)；d：c的局部放大(×400，標(biāo)尺=20 μm)；*：背側(cè)白質(zhì)區(qū)域；▼：灰質(zhì)區(qū)域；↑：軸突

圖1小鼠脊髓損傷后MIF的表達(dá)(縱切面)

a：假手術(shù)組(×100，標(biāo)尺=100 μm)；b：a的局部放大(×400，標(biāo)尺=20 μm)；c：SCI后72 h組(×100，標(biāo)尺=100 μm)；d：c的局部放大(×400，標(biāo)尺=20 μm)；*：背側(cè)白質(zhì)區(qū)域；▼：灰質(zhì)區(qū)域；↑：軸突

圖2小鼠脊髓損傷后MIF的表達(dá)(橫切面)

2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞中MIF和OX42的共表達(dá)

為了檢驗(yàn)脊髓損傷后白質(zhì)和灰質(zhì)中存在的MIF陽(yáng)性細(xì)胞為何種細(xì)胞，本研究進(jìn)行了MIF/OX42的免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)。OX42是特異性活化小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示(圖3)，原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)OX42和MIF，提示脊髓損傷后白質(zhì)和灰質(zhì)中存在的MIF強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞可能為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。

a：顯示細(xì)胞為OX42陽(yáng)性；b：顯示細(xì)胞同時(shí)為MIF陽(yáng)性；c：DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；d：a、b、c的疊加

圖3小膠質(zhì)細(xì)胞中MIF和OX42的表達(dá)(×400，標(biāo)尺=20μm)

2.3 假手術(shù)組及損傷后MIF、RhoA基因轉(zhuǎn)錄

MIF在脊髓砸傷后表達(dá)增加，為了探尋其增加的意義，本研究檢測(cè)了損傷后MIF以及與軸突再生相關(guān)的RhoA的mRNA水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所用數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)的總數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示(圖4)，假手術(shù)組中MIF的mRNA水平很低，損傷72 h后MIF在基因轉(zhuǎn)錄水平上升高，2組之間有顯著差異(P<0.05)。RhoA的水平與軸突的再生密切相關(guān)，相對(duì)于假手術(shù)組，損傷后72 h RhoA在基因轉(zhuǎn)錄水平上也顯著升高(P<0.05)。分子量為400 ～500 bp處，損傷72 h后出現(xiàn)了非特異條帶，推測(cè)是由于砸傷引起的物理沖擊和化學(xué)炎癥損傷影響了RNA的轉(zhuǎn)錄過程，模板鏈斷裂并最終產(chǎn)生斷裂的DNA片段。

a：DNA瓊脂糖電泳圖；b：對(duì)電泳結(jié)果分析柱形圖(*：與Ctrl比較，P<0.05)

圖4損傷后72hMIF和RhoA的mRNA水平升高

3 討論

巨噬細(xì)胞遷移抑制因子是機(jī)體固有免疫調(diào)控當(dāng)中的一類重要分子，在壓迫性脊髓損傷急性期表達(dá)上調(diào)[5]，但對(duì)其上調(diào)的意義目前尚無(wú)定論。研究顯示，敲除MIF基因有助于壓迫性脊髓損傷小鼠后肢功能的恢復(fù)，提示MIF的存在阻礙了SCI后受損神經(jīng)元的存活[9]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，MIF是一個(gè)促炎因子，主要參與脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，但炎癥反應(yīng)具有雙刃劍的效應(yīng)，MIF在其中的作用尚不明確。已知損傷后MIF在膠質(zhì)細(xì)胞中水平增加，但神經(jīng)元中MIF的水平改變不顯著，提示增加的MIF可能主要來源于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MIF的mRNA主要位于神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞，但MIF抗體標(biāo)記則同時(shí)在星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中呈現(xiàn)陽(yáng)性[10]。在本研究中，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示損傷后神經(jīng)元中MIF表達(dá)上調(diào)不顯著，而增加的MIF主要集中表達(dá)在阿米巴樣的膠質(zhì)細(xì)胞中，細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果也證明OX42標(biāo)記的原代小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MIF，提示重物砸傷所致脊髓損傷后組織和細(xì)胞中增加的MIF主要來源于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。

目前已有的研究顯示MIF除了作為促炎因子以外，還與星形膠質(zhì)細(xì)胞參與的血腦屏障通透性調(diào)節(jié)功能相關(guān)[11]，并進(jìn)而影響脊髓損傷后穿越CNS血腦屏障的巨噬細(xì)胞，使其直接或通過分泌某些活性因子在損傷局部發(fā)揮作用[12]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，損傷后星形膠質(zhì)和少突膠質(zhì)樣的細(xì)胞呈現(xiàn)MIF陽(yáng)性，而這兩類細(xì)胞并非MIF在CNS內(nèi)的主要來源，可能的解釋是這些膠質(zhì)細(xì)胞是從胞外環(huán)境中攝取了MIF，但它們通過何種機(jī)制獲取MIF還不清楚。本文推測(cè)，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的MIF，可能通過與星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞膜上的分子作用啟動(dòng)內(nèi)吞機(jī)制攝取MIF。本研究隨后檢測(cè)了與軸突再生關(guān)系密切的RhoA，其mRNA水平明顯升高，不利于軸突再生。同時(shí)，損傷后MIF mRNA水平的增加則進(jìn)一步提示其與再生抑制存在一定的關(guān)系[13]。有研究表明，原代培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞中，MIF可以通過RhoA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[14]。本研究發(fā)現(xiàn)損傷后MIF與RhoA都出現(xiàn)了明顯上調(diào)，這些結(jié)果提示，一方面，進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞的MIF可能通過調(diào)控其細(xì)胞周期促進(jìn)其增殖形成膠質(zhì)瘢痕[5]；另一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的MIF還可能進(jìn)一步影響脊髓損傷后巨噬細(xì)胞的進(jìn)入，調(diào)控巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后局部微環(huán)境中對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用，比如清除髓鞘碎片以及阻礙膠質(zhì)瘢痕的形成等。因此，MIF將對(duì)軸突損傷后再生的微環(huán)境產(chǎn)生重要的影響，研究MIF除了炎癥作用以外的其他效應(yīng)將有助于理解脊髓再生困難的原因和潛在的機(jī)制，為促進(jìn)脊髓損傷后的修復(fù)提供新的策略。

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