LATS1-YAP信號通路對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成的調(diào)控

盧 昊，劉 婷，陳 宇，毛彤春，雷澤源，樊東力 (第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院整形外科，重慶 400037)

皮膚成纖維細(xì)胞是皮膚真皮中最主要的細(xì)胞成分，在合成分泌纖維和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中扮演著重要的角色。在皮膚受到創(chuàng)傷后，皮膚成纖維細(xì)胞作為主要修復(fù)細(xì)胞，在趨化因子的作用下由創(chuàng)周向創(chuàng)面移位，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)、層聯(lián)蛋白等，成纖維細(xì)胞與ECM相互作用，在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而當(dāng)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中成纖維細(xì)胞過度增殖，則會導(dǎo)致瘢痕或瘢痕疙瘩的出現(xiàn)，影響形體的美觀，乃至影響功能。故如何調(diào)控皮膚成纖維細(xì)胞的增殖成為皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和阻止瘢痕形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前調(diào)控皮膚成纖維增殖的機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討LATS1-YAP信號通路對人皮膚成纖維細(xì)胞HS27增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成的調(diào)控作用，以期為皮膚創(chuàng)傷后修復(fù)以及阻止創(chuàng)傷后瘢痕形成提供潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和實(shí)驗(yàn)分組

人皮膚成纖維細(xì)胞HS27購自ATCC。DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)等胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，LATS1 siRNA、YAP siRNA由上海生物工程有限公司合成。LATS1兔單克隆抗體、YAP兔單克隆抗體、collagenⅠ兔單克隆抗體均購自英國Abcam公司。蛋白提取試劑盒、二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔、GAPDH兔多克隆抗體均購自北京天德悅生物科技公司。BeyoECL plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。lipofectmine2000購自美國Invitrogen公司。

LATS1 siRNA干預(yù)組:使用LATS1 siRNA對HS27細(xì)胞進(jìn)行干預(yù);YAP siRNA干預(yù)組:使用YAP siRNA對HS27細(xì)胞進(jìn)行干預(yù);未干預(yù)組HS27細(xì)胞只加入等量的培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人皮膚成纖維細(xì)胞HS27培養(yǎng)于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，實(shí)驗(yàn)中選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 LATS1 siRNA和YAP siRNA的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d將對數(shù)生長期的HS27細(xì)胞分別接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待培養(yǎng)板中細(xì)胞約60%融合時(shí)開始轉(zhuǎn)染。取無血清DMEM培養(yǎng)基240 μl與10 μl lipofectmine2000混勻，再取無血清 DMEM 培養(yǎng)基240 μl與10μlLATS1/YAPsiRNA混勻，放置5～10min后將上述2種溶液混合，再放置20 min。將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌1次后將脂質(zhì)體siRNA混合液加入培養(yǎng)板，孵育6 h后吸取培養(yǎng)基，換為10%FBS的高糖DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 檢測 LATS1、YAP和collagenⅠ蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加細(xì)胞蛋白提取液提取總蛋白，置于冰中裂解約20 min后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞于EP管中，4℃1 2 0 0 0 r/min離心10 min，取上清用核酸蛋白檢測儀測蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)成一致，加入5×Loading buffer后在沸水中煮5 min變性。配制8%分離膠、5%濃縮膠后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA濕轉(zhuǎn)120 min，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入5%脫脂奶粉稀釋的LATS1、YAP和collagenⅠ一抗(稀釋濃度均為1∶1 000)中4℃孵育過夜，次日用TBST漂洗6次，每次5 min，放入5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)抗體中室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以GADPH內(nèi)參蛋白校正。

1.2.4 檢測HS27細(xì)胞的活力 以每孔103個(gè)細(xì)胞將HS27細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待轉(zhuǎn)染48 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液。每孔加入150 μl DMSO，輕微振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解，酶標(biāo)儀選擇490 nm波長，測定各孔吸光度(A)值，空白對照孔調(diào)零。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Image-Pro Plus 10.0對電泳圖像進(jìn)行分析;使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，2組均數(shù)間比較用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同干預(yù)條件下LATS1蛋白的表達(dá)

LATS1 siRNA干預(yù)組LATS1蛋白表達(dá)顯著低于未干預(yù)組(P＜0.05)，YAP siRNA干預(yù)組LATS1蛋白表達(dá)與未干預(yù)組無顯著差異(P＞0.05)，LATS1 siRNA干預(yù)組LATS1蛋白的表達(dá)顯著低于YAP siRNA干預(yù)組(P＜0.05)，見圖1。

2.2 不同干預(yù)條件下YAP蛋白的表達(dá)

LATS1 siRNA干預(yù)組YAP蛋白表達(dá)顯著高于未干預(yù)組(P＜0.05)，YAP siRNA干預(yù)組YAP蛋白表達(dá)顯著低于未干預(yù)組(P＜0.05)，LATS1 siRNA干預(yù)組YAP蛋白的表達(dá)顯著高于YAP siRNA 干預(yù)組(P ＜0.05)，見圖2。

2.3 不同干預(yù)條件下collagenⅠ蛋白的表達(dá)

LATS1 siRNA干預(yù)組collagenⅠ蛋白表達(dá)顯著高于未干預(yù)組(P＜0.05)，YAP siRNA干預(yù)組collagenⅠ蛋白表達(dá)顯著低于未干預(yù)組(P＜0.05)，LATS1 siRNA干預(yù)組collagenⅠ蛋白的表達(dá)顯著高于YAP siRNA干預(yù)組(P＜0.05)，見圖3。

圖1 LATS1蛋白的表達(dá)

圖2 YAP蛋白的表達(dá)

圖3 collagenⅠ蛋白的表達(dá)

2.4 不同干預(yù)條件下HS27的活性

LATS1 siRNA干預(yù)組HS27細(xì)胞活力顯著高于為未干預(yù)組(P＜0.05)，YAP siRNA干預(yù)組HS27細(xì)胞活力顯著低于未干預(yù)組(P＜0.05)，LATS1 siRNA干預(yù)組HS27細(xì)胞活力顯著高于YAP siRNA 干預(yù)組(P ＜0.05)，見圖4。

圖4 HS27細(xì)胞的活性變化

3 討論

皮膚是人身體最大的器官，主要承擔(dān)著保護(hù)身體、排汗、感覺冷熱和壓力的功能，使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生物侵襲。當(dāng)皮膚受到損傷后，身體中多種細(xì)胞內(nèi)外信號通路激活，使成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞等胞內(nèi)一些相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞的極性發(fā)生顯著的改變，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、遷移、分化，從而修復(fù)皮膚創(chuàng)傷［1-2］。多數(shù)皮膚受損后修復(fù)時(shí)會出現(xiàn)成纖維細(xì)胞的過度增殖和ECM的紊亂，從而導(dǎo)致瘢痕的出現(xiàn)［3］，極少數(shù)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中會出現(xiàn)異常增生和惡變［4］，但目前尚無有效方法阻止瘢痕的形成甚至惡變，其主要原因是調(diào)控真皮層成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不清楚。

LATS1和YAP蛋白是Hippo信號通路中的關(guān)鍵元件。Hippo信號通路具有調(diào)節(jié)器官體積、保持細(xì)胞增殖凋亡平衡、參與細(xì)胞接觸性抑制調(diào)控等作用［5-6］，而該通路的異常或失活可導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖以及腫瘤的形成［7］。研究發(fā)現(xiàn)LATS1基因敲除后，小鼠常死于胚胎階段，即使存活下來也伴有腫瘤發(fā)生［8］，提示LATS1在細(xì)胞增殖、分化以及抑制腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。YAP是經(jīng)典Hippo通路的主要效應(yīng)因子，被其上游Wts磷酸化而失活，YAP的過度表達(dá)會造成組織器官的增大，相反YAP的失活會造成組織器官萎縮。Hippo通路中其他因子的突變(如LATS1)受到抑制能增加YAP的活性，導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子cyclinE、DIAP1等表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［9］。本研究同樣證實(shí)了抑制LATS1，增加了YAP的表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞的活力，相反YAP受到抑制后，HS27細(xì)胞活力也顯著下降。

皮膚中存在多種膠原蛋白，其中collagenⅠ是含量最豐富的膠原蛋白，占其干重的90%以上［10］。真皮層collagenⅠ的減少是皮膚皺紋形成的主要原因，同時(shí)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)紊亂collagenⅠ是形成瘢痕的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11］，提示膠原蛋白的合成對維持組織的完整性發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β和其他的細(xì)胞因子可促進(jìn)collagenⅠmRNA的翻譯和轉(zhuǎn)錄［12-13］，而MMPs可負(fù)性調(diào)節(jié) collagenⅠ的表達(dá)［14］。其他研究指出抑制Smad2/3的表達(dá)可顯著下調(diào)collagenⅠ合成［15］。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制LATS1時(shí)，collagenⅠ的合成增加，相反抑制 YAP時(shí)，collagenⅠ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示LATS1-YAP信號通路可調(diào)控collagenⅠ的表達(dá)，但其機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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