★ 黃丹娥 崔景朝 付建武 張建軍 曾曉會 黃雪君 姚楠

(廣東省中醫(yī)研究所 廣東 廣州 510095)

姜黃素具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、改善心血管功能、抗炎、抗病毒、保肝、增強免疫力等，具有良好的藥理活性和應用前景[1]，但是姜黃素存在疏水性強、口服吸收少、穩(wěn)定性差以及體內生物利用度低等缺陷，很大程度上影響了其在臨床上的使用[2]。

研究表明胡椒堿可提高動物和人血清姜黃素含量和生物利用度，主要是因為胡椒堿為體內葡萄糖醛酸酶抑制劑，可降低姜黃素的代謝[3]。

脂質立方液晶的處方比例不僅能夠影響立方液晶本身的物理化學性質，而且對自身的結構、晶型以及藥物的包封率和載藥量也具有重要的意義。針對姜黃素在水中溶解度低、穩(wěn)定性較差、生物利用度低等問題，將姜黃素與胡椒堿進行配伍，制備姜黃素脂質體立方液晶制劑。為了保證脂質立方相晶體結構以及提高藥物的包封率和載藥量，本論文對復方姜黃素脂質立方液晶處方工藝進行了摸索。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器 Agilent1200高效液相色譜儀(G1312A型二元泵，G1329A型自動進樣器，G1316A型柱溫箱，G1314B型VWD檢測器，美國)；Kromasil-C18柱(4.6mm×250 mm，5μm，瑞典EKA Chemicals公司)；XS205DU型1/10萬電子分析天平(METTLER TOLEDO)；5424型小型高速離心機(德國 Eppendorf公司)；恒溫數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；20～200μL移液槍(BIOHIT)；36MM透析袋(BIOSHARP，USA)；milli-Q advantage超純水器(密理博中國有限公司)；kel-2000b實驗室高精度顯微加熱臺(南京凱爾儀器有限公司)；BX41-P偏光顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；Q500超聲波破碎儀(美國Misonix公司)；LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(上海安亭科學儀器廠)；HJ-4A型數顯恒溫多頭強力磁力攪拌器(金壇市順華儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑 姜黃素(四川金郁金科技開發(fā)有限公司，純度98%)；胡椒堿(海南尊鰲科技開發(fā)有限公司，純度95%)；姜黃素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110823-201004，純度98.8%)；胡椒堿標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110775-201104，純度99.2%)；植烷三醇(東京化成工業(yè)株式會社，純度>98%)；甘油單油酸酯(美國Amresco有限公司，純度99%)；維他命E乙酸酯(購自于美國sigma公司，純度99%)；Lutrol F127(巴斯夫中國有限公司)；葡聚糖凝膠G-50(AR，上海雅吉生物科技有限公司)；36 mm透析袋(美國Biosharp公司)；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 單因素考察

2.1.1 植烷三醇用量考察 準確稱取0.1g，0.2g和0.3g Phytantriol脂質材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.04g F127于100mL燒杯中，加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細胞超聲儀上超聲5min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復方姜黃素立方液晶混懸液。將上述混懸液分別定容至25mL，精密吸取0.1mL至5mL的量瓶中，加入甲醇適量，超聲15min，冷卻至室溫，加入甲醇稀釋并定容至刻度；精密量取上述溶液100μL，加入微型凝膠柱(徑高比1∶6)上表面，離心。采用相同體積的蒸餾水重復洗脫6次，收集合并洗脫液，加入甲醇適量超聲15min，冷卻至室溫，加入甲醇稀釋并定容至5mL，0.45μm微孔濾膜濾過，測定液晶樣品中姜黃素和胡椒堿的包封率。同時精密量取復方姜黃素脂質立方液晶混懸液10mL于已恒重的蒸發(fā)皿中，減壓冷凍干燥至恒重，稱定重量，計算姜黃素和胡椒堿的載藥量，結果見下表1。

表1 植烷三醇不同用量考察

由上表結果可知，不同的植烷三醇用量對姜黃素和胡椒堿的包封率無明顯影響，同時載藥量隨著植烷三醇用量的增加而逐漸減小，說明植烷三醇已充分參與了脂質立方液晶結構的組裝。隨著植烷三醇用量的增加，并沒有顯著提高藥物的包封率，相反降低了立方液晶載藥量，故確定植烷三醇用量為0.1g。

2.1.2 穩(wěn)定劑種類考察 依據文獻，選擇F127[4]和Vitamin E Acetate[5]作為植烷三醇/水體系脂質立方液晶穩(wěn)定劑。通過對比F127和Vitamin E Acetate兩種穩(wěn)定劑，考察其對姜黃素和胡椒堿包封率和載藥量的影響。

Phytantriol/F127/water體系的制備：稱取0.1g Phytantriol脂質材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.02g F127于100mL燒杯中，加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細胞超聲儀上超聲5min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復方姜黃素立方液晶混懸液，按照上述測定方法計算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量。

Phytantriol/Vitamin E Acetate/water體系的制備：稱取0.1g Phytantriol脂質材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.02g Vitamin E Acetate于100mL燒杯中，加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細胞超聲儀上超聲5min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復方姜黃素立方液晶混懸液，按照上述測定方法計算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量，結果見表2。

表2 不同穩(wěn)定劑種類的考察

由結果可知，不同的穩(wěn)定劑種類對胡椒堿包封率無顯著性差異，對姜黃素具有較強的選擇性，這可能與藥物和穩(wěn)定劑之間的相互作用有關，本試驗選擇F127作為復方姜黃素脂質立方液晶穩(wěn)定劑。

2.1.3 F127用量考察 稱取0.1g Phytantriol脂質材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；分別稱取相當于植烷三醇質量5%、10%、20%、30%和40%的F127于100mL的燒杯中，加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細胞超聲儀上超聲5min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復方姜黃素立方液晶混懸液。按照上述測定方法計算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量。結果見表3。

表3 F127不同用量的考察

由上表結果可以看出，隨著F127用量的增加，姜黃素和胡椒堿包封率和載藥量呈現先增加后下降趨勢。說明F127在一定范圍內可以參與脂質立方液晶結構的組裝并能支撐整個骨架，但是當用量超過30%，其又可能會導致結構的破壞或者晶型結構的轉變，導致包封率和載藥量的下降。

2.1.4 分散相用量考察 稱取0.1g Phytantriol脂質材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.02g F127于100mL燒杯中，分別加入5mL，10mL，20mL和30mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細胞超聲儀上超聲5 min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5 s)，即得大小均一的復方姜黃素立方液晶混懸液。按照上述測定方法計算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量，結果見下表4。

表4 不同分散相量的考察

由結果可知，分散相用量在一定范圍內對復方姜黃素脂質立方液晶具有顯著性影響。分散相用量較少，脂質立方液晶納米粒濃度較高，樣品易于聚集，穩(wěn)定性下降。當分散相用量超過10mL，胡椒堿和姜黃素包封率和載藥量均趨于穩(wěn)定。

2.1.5 藥物用量 稱取0.1g Phytantriol脂質材料于西林瓶中，加入相當于植烷三醇質量的3%，5%，7%和10%的姜黃素和胡椒堿(質量比為3∶1)無水乙醇溶液，超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.02g F127于100mL燒杯中，分別加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細胞超聲儀上超

聲5min(超聲功率：300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復方姜黃素立方液晶混懸液。按照上述測定方法計算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量。結果見表5。

表5 不同藥物用量的考察

隨著藥物用量的增加，胡椒堿和姜黃素包封率、載藥量均有一定的提高，但當投藥量達到10%，姜黃素包封率和載藥量顯著下降，說明藥物用量過高會對脂質立方液晶的脂質雙分子層造成影響，同時過高的藥物濃度也可能使得納米粒的晶型結構發(fā)生改變。

2.2 均勻設計優(yōu)化處方工藝

根據單因素實驗結果，選擇影響姜黃素和胡椒堿包封率較大的三個因素：藥量、F127用量以及分散相用量。固定植烷三醇用量為0.1g，選取藥量、F127用量以及分散相用量三個因素三個水平，采用U8(83)均勻設計表，以復方姜黃素的包封率和載藥量為評價指標進行綜合加權評分，優(yōu)化復方姜黃素脂質立方液晶最佳處方工藝。因素水平表見表6。

表6 因素水平表

根據U8(83)均勻設計表，將前面各因素的水平數進行合并{1,2}=1，{3,4}=2，{5,6}=3，{7,8}=4;將第4列的水平合并為四水平，試驗安排與結果見表7。

表7 均勻設計實驗安排表

綜合評分=胡椒堿包封率/胡椒堿包封率max×0.25+姜黃素包封率/姜黃素包封率max×0.25+胡椒堿載藥量/胡椒堿載藥量max×0.25+姜黃素載藥量/姜黃素載藥量max×0.25。

2.2.1 回歸模型及檢驗 應用DPS 6.55軟件對實驗數據進行二次多項式逐步回歸分析，剔除影響較小的因素，結果顯示，二次項模型所擬合方程意義顯著(結果見表8)，所得回歸方程分別為：

Y=3.4452-27.9301X1-26.6210X2+166.785 9X1X2+51.182 0X22

其中X1為藥量(%)，X2為F127用量(%)，X3為分散相用量(g)，Y為復方姜黃素包封率和載藥量的綜合評分。

表8 回歸模型方差分析表

通過分析各自變量與因變量之間的關系(如圖1)，可以看出X1(藥量)與綜合評分呈現正相關，X2(F127用量)與綜合評分呈現曲線相關，X3(加水量)與綜合評分無相關關系。說明F127和藥物用量(藥輔比)是影響復方姜黃素包封率和載藥量的主要因素；分散相用量對復方姜黃素包封率和載藥量影響不顯著，只改變藥物的分散濃度。

X1：藥量；X2：F127用量；X3：分散相用量

圖2 藥量與F127用量與綜合評分的三維效應面圖

圖3 藥量與分散相用量對綜合評分的三維效應面圖

2.2.2 效應面分析 根據回歸方程，選擇兩個不同的自變量和因變量做三維效應面圖(如圖2～4)，由圖可知，隨著藥量的增加，復方姜黃素包封率和載藥量呈現明顯增加趨勢，說明在一定的范圍內，隨著藥量的增加，脂質立方液晶的包封率和載藥量隨之增加；而分散相用量對綜合評分影響不顯著，說明分散相用量只是影響藥物的濃度，不影響藥物的包封率和載藥量；F127用量對復方姜黃素包封率和載藥量影響較為顯著，呈現二次項關系，這主要是因為F127參與脂質立方液晶結構的組裝和支撐，在一定的范圍內增加F127用量，有利于脂質立方液晶結構的形成和骨架的支撐，但當用量過高，反而不利于納米結構的形成和藥物的包封。

圖4 分散相用量與F127對綜合評分的三維效應面圖

2.2.3 效應值優(yōu)化及驗證 結合二次回歸模型的數學分析結果，軟件系統(tǒng)給出最高評分時各個因素組合：植烷三醇0.1g，藥量為8mg，F127用量為25mg，分散相用量20g。按優(yōu)選的最佳處方工藝，進行3批驗證試驗，計算綜合評分。結果見表9。由表結果可知，驗證三批試驗結果相差較小，胡椒堿和姜黃素的包封率均在70%以上，胡椒堿和姜黃素載藥量分別在0.5%和2%以上。

表9 處方工藝驗證試驗

3 討論

篩選了輔料的用量、穩(wěn)定劑的種類和用量、分散體系用量以及藥物用量對姜黃素和胡椒堿包封率和載藥量的影響，并采用均勻設計優(yōu)化處方工藝，得到復方姜黃素脂質立方液晶最佳制備處方，即：植烷三醇0.1g，藥量為8mg，F127用量為25mg，加水量20g。制得的復方姜黃素脂質立方液晶納米粒姜黃素包封率達到了70%以上，載藥量達到了2.5%；胡椒堿包封率達到了75%以上，載藥量達到了0.8%以上，滿足了實驗要求。

[1]崔晶,翟光喜,婁紅祥.姜黃素的研究進展[J].中南藥學,2005,3(2):108-111.

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