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(1.江西中醫(yī)藥大學 江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥高等?？茖W校 江西 撫州 344000)

羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉,在我國分布廣泛，資源豐富。羅布麻葉中含有黃酮類化合物、兒茶素等，大量實驗研究表明其對防治高血壓和高血脂有良好的效果[1,2]。近幾年，研究報道羅布麻葉亦具有良好的抗抑郁作用，其作用可能主要與其中的黃酮類化合物特別是金絲桃苷和異槲皮素有關[3]。中藥抗抑郁的作用機制復雜，單一成分并不一定能代替藥材整體成分的藥理作用，因此，本實驗采用羅布麻葉提取液，以總黃酮含量為考察指標，優(yōu)化純化工藝，并比較純化前后對抗抑郁作用的影響，為羅布麻葉抗抑郁作用制劑的開發(fā)奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器 Megafugel O R高速大容量離心機(德國Thermo公司)，BT25S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，KDM型調(diào)溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)，UV759紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器公司)。

1.2 實驗藥材與試劑 羅布麻葉購于江西省南昌市會好康大藥房(產(chǎn)地：天津)，由本校生藥教研室鄧可眾副教授鑒定為正品羅布麻。金絲桃苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111521-201205)；鹽酸氟西汀膠囊(禮來蘇州制藥有限公司，批號：2072A)；CMC-Na(國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20110509)；凈品級D101大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；無水乙醇、硫酸、石油醚等試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 清潔級KM小鼠60只，雌雄各半，體重18～22g，購自江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(贛)2011-0001，實驗前小鼠適應環(huán)境7d。

2 實驗方法

2.1 羅布麻葉的提取與純化

2.1.1 羅布麻葉提取物的制備 依據(jù)文獻[4]，取羅布麻葉80g置于圓底燒瓶中，加800mL40%乙醇水溶液，于70℃下回流提取3次，每次2h，過濾，合并濾液，濃縮成浸膏，按質(zhì)量平均分成兩份，編號為A、B。從A中取浸膏1.1600g(相當于生藥材量6g)，用甲醇溶解并定溶于100mL容量瓶，編號為C，剩余浸膏編號為D，備用。

2.1.2 羅布麻葉提取純化物的制備 依據(jù)文獻[5]，取B用純化水溶解，離心取上清液，石油醚脫脂后濃縮成浸膏，將浸膏溶于熱水，用硫酸調(diào)節(jié)為pH=4，過濾，濾液上D101大孔樹脂柱，依次用水和50%乙醇溶液洗脫。收集乙醇洗脫液并濃縮成浸膏，取浸膏0.3175g(相當于生藥材量6g)，用甲醇溶解并定溶于100mL容量瓶編號為E，剩余浸膏編號為F,備用。

2.2 羅布麻葉總黃酮含量測定方法的建立

2.2.1 對照品的制備 取經(jīng)五氧化二磷干燥的金絲桃苷對照品，精密稱定10.70mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.2140mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 分析方法的建立 精密量取上述對照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL于25mL容量瓶中，分別加純化水至6mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，再加入4%氫氧化鈉溶液10mL，搖勻，用甲醇補足體積至刻度，搖勻，放置15min后，以相應的試劑做空白對照，采用紫外分光光度法，于507nm波長處測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程A=16.077C-0.0026(r=0.9999)，金絲桃苷在0.0043～0.0343mg/mL呈良好的線性關系。本方法的精密度、重現(xiàn)性試驗的RSD分別為2.91%，2.77%，回收率為98.65%。

2.2.3 樣品的測定 分別取0.5mL C和E，按“2.2.2”項所述方法顯色，于507nm波長處測定吸光度，由回歸方程計算出樣品中總黃酮的含量，結果見表1。

表1 樣品測定結果

2.3 羅布麻葉灌胃液樣品的制備 AT(羅布麻葉提取物)和AC(羅布麻葉純化物)灌胃液的制備：分別取D和F浸膏，用1%CMC-Na定容成濃度為以生藥量計含羅布麻葉0.4，0.2g/mL的藥液，分別編號為AT高、低劑量組、AC高、低劑量組，備用。

2.4 動物分組及給藥 將小鼠隨機分為6組，每組10只雌雄各半，分組情況如下：空白組(給予20mL/kg的1%的CMC-Na水溶液)，陽性對照組(取鹽酸氟西汀膠囊50mg用1%的CMC-Na定容于50mL容量瓶即濃度為1mg/mL)，AT高劑量組、AT低劑量組、AC高劑量組、AC低劑量組。各組均連續(xù)灌胃(ig)給藥10d，每天1次，每次0.4mL/20g，末次給藥1 h后測試。

2.5 抗抑郁實驗

2.5.1 小鼠懸尾實驗(TST) 參照Steru等[6]建立的方法，并加以修改，將單個小鼠尾端(在距尾尖部約2cm處)用膠布粘于懸尾箱(35cm×35cm×20cm)上部支架上，使小鼠成倒掛狀態(tài)且頭部離箱底約5cm。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動，但活動一段時間出現(xiàn)間斷性不動，表現(xiàn)出失望狀態(tài)。懸掛時間為6min，記錄后4min內(nèi)懸尾累計不動時間。結果見表2。

2.5.2 強迫游泳實驗(FST) 參照Porsolt等[7]建立的方法，并加以修改，將小鼠單獨放入高25cm、直徑12cm的圓柱形玻璃缸中，缸內(nèi)水深10cm，水溫25±2℃，從小鼠放入水后計時6min，記錄后4min內(nèi)游泳累計不動時間。結果見表2。

2.5.3 開場實驗(OFT) 參照Archer等[8]建立的方法。敞箱裝置為長和寬各40cm、高25cm、底面劃分為16個等邊方格的紙箱．內(nèi)面用黑漆涂滿。將小鼠放人中心方格內(nèi)，觀察小鼠4min，計算后3min穿越格數(shù)(四爪均進入的方格方可計數(shù))，徹底清潔敞箱后再進行下1只小鼠的觀察。結果見表2。

3 實驗結果

3.1 羅布麻葉AT和AC對小鼠TST不動時間的影響 與空白組對比，AT高劑量、陽性藥FH和AC高、低劑量均可顯著縮短懸尾不動時間(P<0.05)，提示在既定給藥方案內(nèi)，AT、FH和AC在TST實驗中均有顯著的抗抑郁作用，且AC呈現(xiàn)出良好的量效關系；羅布麻葉AT低劑量對此有縮短趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示AT低劑量在既定給藥方案內(nèi)沒有顯著的抗抑郁作用，見表2。

3.2 羅布麻葉AT和AC對小鼠FST不動時間的影響 與空白組對比，AT高劑量、陽性藥FH和AC高、低劑量可顯著縮短懸尾不動時間(P<0.05)，提示在既定給藥方案內(nèi)，AT、FH和AC在FST實驗中均有顯著的抗抑郁作用；羅布麻葉AT低劑量對此有縮短趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示AT低劑量在既定給藥方案內(nèi)沒有顯著的抗抑郁作用，見表2。

3.3 羅布麻葉AT和AC對小鼠OFT不動時間的影響 小鼠OFT穿格次數(shù)，各組間比較均無顯著性差異(P>0.05)，結果見表2。

表2 羅布麻葉總黃酮對小鼠TST和FST不動時間及OFT穿格次數(shù)的影響±s，n=10)

4 討論

TST和FST是最常用的抗抑郁藥物初篩模型，其具有操作簡單、快捷、敏感度高等特點[9]。本實驗采用小鼠TST和FST抑郁癥模型比較羅布麻葉提取液純化前后的抗抑郁效果，實驗結果表明，提取液純化后由于總黃酮含量的增加，在等劑量的情況下AC比AT的抗抑郁效果更顯著，且存在顯著性差異(P<0.05)。

TST和FST抑郁癥模型幾乎對所有的抗抑郁藥都有很高的敏感性，但中藥中若含中樞興奮性成分可能影響小鼠的自主活動，出現(xiàn)假陽性結果[10]。為避免可能出現(xiàn)的假陽性結果，本文采用OFT實驗考察各實驗組對小鼠自主活動的影響，結果顯示各實驗組對小鼠OFT穿格次數(shù)無明顯影響，從而排除羅布麻葉中可能含有中樞興奮性成分造成的假陽性結果。

綜上所述，羅布麻葉具有抗抑郁作用且其藥效與總黃酮的含量有關，但其作用機制尚未明確，有待進一步研究。

[1]翟麗莉，呂建華.羅布麻的現(xiàn)代藥理研究及臨床應用[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育,2009,7(6):187.

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[3]Butterweck V, Simbrey K, Seo S, et al. Long-term effectsof an Apocynum velleturn extract on brain monoaminelevels and beta-AR density in rats [J].PharmacolBiochem Behav,2003, 75(3):557-564.

[4]楊華生，張坤，尹小英，等.多指標正交試驗優(yōu)選羅布麻定時脈沖片提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(12):14-16.

[5]吳桂梅,劉春明,張語遲，等.羅布麻葉黃酮類化合物的分離提取及對體外皮質(zhì)酮損傷的保護作用評價[J].藥物分析雜志,2011,31(6):1 012-1 015.

[6]Steru L, Chermat R, Thierry B, et al. The tail suspensiontest: a new method for screening antidepressants in mice[J].Psychopharmacology,1985,85(3):367-670.

[7]Porsolt R D, Bertin A, Jalfre M. Behavioural despair inmice: A primary screening test for antidepressants[J].Arch Int Pharmacodyn Ther, 1997,229(2):327-336.

[8]Archer J．Tests for emotionality in rats and mice：a review[J].Anim Behav，1973，21(2)：205-235.

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[10]孫曉菲，林青，代蓉，等.天麻乙酸乙酯提取物對行為絕望小鼠的抗抑郁作用[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(7):205-207.