★ 楊婕 徐桂香 黃多希 盧藝 許向群

(江西中醫(yī)藥大學 江西 南昌 330004)

靈芝是一種保健和藥用價值很高的大型真菌，而黑靈芝被稱為靈芝中的極品，對人體保健功效，遠比其它種類的靈芝高。靈芝多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等作用，還可作為腫瘤化療和放療的輔助治療。

膜分離技術(shù)具有操作簡單、節(jié)能、無污染，可在常溫下連續(xù)操作等優(yōu)點,特別適用于熱敏性物質(zhì)的分離純化,該技術(shù)在化工、食品、生物、制藥等領(lǐng)域得到越來越廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。本課題組以江西贛南出產(chǎn)的黑靈芝為研究對象，利用靈芝多糖與其他成分分子量差異先采用微濾膜對靈芝浸提液進行除雜，然后采用超濾技術(shù)，對靈芝水提物進行分離，分離出不同分子量的靈芝多糖，為后期考察不同分子量段靈芝多糖的免疫增強活性，選擇純化具有免疫活性的靈芝多糖組分，以及靈芝多糖保健食品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，也為膜分離技術(shù)應(yīng)用于贛南黑靈芝多糖分離純化的產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗藥材 贛南黑靈芝(采自江西贛南地區(qū))。

1.2 實驗試劑 葡萄糖(西隴化工股份有限公司)、氫氧化鈉(天津市恒興化學試劑制造有限公司)、重蒸苯酚(上海恒遠生物科技有限公司)、濃硫酸(東莞市雙德化工有限公司)，均為分析純。

1.3 儀器設(shè)備 HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；BS214分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-ⅢB(浙江臨江市精工真空設(shè)備廠)；RE-5233型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV9100A紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱、Megafugel.OR型高速大容量離心機(德國Thermo公司)；Millipore超濾儀；DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

2 實驗方法和結(jié)果

2.1 贛南黑靈芝多糖的提取

2.1.1 贛南黑靈芝飲片的前處理 將贛南黑靈芝飲片洗凈，置潔凈托盤中鋪勻后放入電熱恒溫鼓風干燥箱中在50℃的條件下干燥，待贛南黑靈芝飲片干燥至用手輕輕碾碎時即取出；再采用高速粉碎機對靈芝進行破碎，并過60目篩。

2.1.2 贛南黑靈芝多糖的提取[2]熱水提取多糖時間1 h比較合適，時間太長，可能引起糖結(jié)構(gòu)的變化和破壞，甚至使其中的五碳環(huán)或六碳環(huán)裂解，導致多糖的含量下降。熱水浸提的溫度也不宜過高，過高有可能破壞多糖的結(jié)構(gòu)。稱取適量靈芝粉末，然后加15倍質(zhì)量的水，在溫度90℃的條件下浸提2h。

2.2 贛南黑靈芝多糖的微濾膜除雜 將贛南黑靈芝多糖粗提取液用離心機在4000r/min，25℃條件下離心15min，取上清液。靈芝水提液中除了含有靈芝多糖外，還含有大分子的蛋白質(zhì)和一些雜質(zhì)，故選用微濾膜將靈芝水提液中的雜質(zhì)及大分子的蛋白質(zhì)除去。我們選用無機微濾膜N100和N30兩種不同型號的微濾膜對靈芝水提液進行除雜，比較其效果，選擇更合適的一種。其工作條件為：進口壓力0.26MPa，出口壓力0.14MPa、操作溫度60℃，流量為90L/min。靈芝多糖的測定采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖為標準品。

雜質(zhì)截留率采用公式：R=(1-Cp/Ci)×100%

式中：R為雜質(zhì)截留率；Cp為透過液中雜質(zhì)的濃度，(mg/L)；Ci為原液中雜質(zhì)的濃度，(mg/L)。

表1 微濾膜N100與N30的除雜效果表

用微濾膜進行除雜試驗時，每10 min測1次膜的通量。納濾膜N100與N30的通量衰減曲線見圖1。結(jié)果顯示，微濾膜N30和微濾膜N100除雜效果差別不大，除雜后固含物的差別也不大，但是微濾膜N100要高于N30的平均通量，從經(jīng)濟和效率角度考慮，選擇微濾膜N100更合適。

圖1 納濾膜N100與N30的通量衰減曲線

2.3 贛南黑靈芝多糖不同分子量段的超濾分離 組成靈芝多糖的單糖類型以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖為主，還有少量巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、海藻糖等，少數(shù)多糖由單一葡萄糖組成?？刂瞥瑸V壓力為0.08MPa，分別用分子截流量為100，30，10ku的超濾膜，將粗提物按分子量大

小分為>100ku(AGP1)、30～100ku(AGP2)、10～30ku(AGP3)和<10ku(AGP4)四部分，冷凍干燥，稱重，計算得率。

各分子量段多糖所占的百分比按下式計算:ω(%)=W1/W0×100。式中:W1為各分子量段多糖的質(zhì)量;W0為四部分多糖的質(zhì)量之和。

總糖含量測定：采用苯酚-硫酸法測定AGP1～AGP4中的總糖含量，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示在四段多糖中，分子量>100ku的部分(AGP1)所占比例最高，為41.66%，分子量為10～30ku的部分(AGP3)所占比例最低，約為1.04%，分子量為10～30ku的部分(AGP2)和分子量<10ku的部分(AGP4)所占比例分別為20.13%和27.72%。各分子量段多糖的總糖含量存在一定差異，AGP1的總糖含量最高，為52.77%，AGP4的總糖含量最低，為41.03%。

表2 各分子段多糖得率及總糖含量

4 結(jié)論

超濾技術(shù)作為一項新興的高效分離技術(shù)，是一個物理處理過程，具有操作簡單，能耗少，工序簡捷的特點，采用超濾分離得到四個不同分子量段的贛南黑靈芝多糖組分，總糖含量及單糖組成分析表明四者總糖含量存在一定差異。相關(guān)結(jié)果可為靈芝多糖類保健食品的工業(yè)開發(fā)提供理論支撐。

[1]高續(xù)春.多糖提取純化方法研究進展[J].榆林學院學報，2009，19(4):65-67.

[2]張洪杰，王廣樂.贛南黑靈芝中多糖提取工藝的研究[J].江蘇科技大學學報(自然科學版)，2013，27(1)：80-84.

[3]董艷.膜分離提取純化中藥多糖的工藝研究[D].天津：天津大學,2007.

[4]楊勇杰，姜瑞芝，陳英紅，等.苯酚-硫酸法測定雜多糖含量的研究[J].中成藥，2005,27(6)：706-708.

[5]張慶雷，周宏兵.膜分離技術(shù)及其在多糖分離純化研究中的應(yīng)用[J].食品與藥品，2009,11(5)：60-62.

[6]王湛.膜分離技術(shù)基礎(chǔ)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2006.