王淑琴，李潤成，黎 碩

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

湖南耒陽某豬場(chǎng)自2012年9月份開始，50～80日齡的保育豬陸續(xù)出現(xiàn)體溫升高、4 0℃左右，皮毛粗亂、食欲減退、消瘦、呼吸困難、發(fā)病后期四肢關(guān)節(jié)腫大，不能站立的情況。發(fā)病率2 0%～3 0%左右，使用各種抗生素預(yù)防和治療效果均不明顯，保育舍小豬總死亡率達(dá)1 0%左右，沒有死亡的小豬多數(shù)變成僵豬，生長速度緩慢、精神狀態(tài)不佳。

由于該豬場(chǎng)小豬沒有進(jìn)行過藍(lán)耳病毒、圓環(huán)病毒疫苗接種，根據(jù)臨床癥狀，獸醫(yī)懷疑豬群存在藍(lán)耳病毒、圓環(huán)病毒感染，同時(shí)可能混有細(xì)菌的繼發(fā)感染，采集了1 4日齡、3 0日齡、4 0日齡、6 0日齡、7 0日齡的小豬血液以及隨機(jī)挑取4頭發(fā)病小豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。對(duì)7份1 4日齡小豬的血液以及3 0、4 0、6 0日齡小豬的血液各8份檢測(cè)了藍(lán)耳病毒抗體，并根據(jù)群體大小抽取了7份1 4日齡小豬血液、8份40日齡小豬的血液、8份6 0日齡小豬的血液、8份7 0日齡小豬的血液檢測(cè)了圓環(huán)病毒抗體，此外，還對(duì)4頭發(fā)病保育豬的病料檢測(cè)了豬瘟、藍(lán)耳病毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該豬場(chǎng)保育豬群在14～3 0日齡期間感染了藍(lán)耳病毒，但沒有表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，直到5 0～8 0日齡出現(xiàn)圓環(huán)病毒感染后才表現(xiàn)出明顯發(fā)病表現(xiàn)，且多數(shù)病豬存在鏈球菌的繼發(fā)感染。現(xiàn)報(bào)告如下：

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 檢測(cè)樣本

3 9份小豬血液（其中7份1 4日齡小豬的血液、8份3 0日齡小豬的血液、8份40日齡小豬的血液、8份6 0日齡小豬的血液、8份7 0日齡小豬的血液），4份來自5 0～8 0日齡發(fā)病小豬的病料。

1.2 抗體檢測(cè)試劑盒

藍(lán)耳病毒抗體檢測(cè)試劑盒購自美國IDEXX公司，圓環(huán)病毒抗體檢測(cè)方法為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建而成，見文獻(xiàn)[1]。

1.3 分子生物學(xué)檢測(cè)主要試劑

Taq酶，dNTP、DNA Marker購自大連寶生物，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentes，TRIZOL試劑購自Invitrogen公司

1.4 不同日齡斷小豬的臨床觀察及解剖病豬的病理變化分析

1.4.1 臨床表現(xiàn)觀察

對(duì)沒有斷奶的哺乳仔豬、剛斷奶的仔豬、5 0～6 0日齡的斷奶仔豬、7 0～8 0日齡的斷奶仔豬進(jìn)行臨床觀察，比較不同年齡段小豬的健康狀況。

1.4.2 病理解剖觀察

解剖發(fā)病小豬觀察小豬各臟器的病理變化情況。

1.5 血清抗體檢測(cè)

1.5.1 藍(lán)耳病毒抗體檢測(cè)

根據(jù)群體大小選取7份1 4日齡小豬的血液，以及3 0、4 0、6 0日齡小豬的血液各8份檢測(cè)藍(lán)耳病毒抗體，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5.2 圓環(huán)病毒抗體檢測(cè)

根據(jù)群體大小抽取了7份1 4日齡小豬血液、8份4 0日齡小豬的血液、8份6 0日齡小豬的血液、8份7 0日齡小豬的血液檢測(cè)了圓環(huán)病毒抗體，具體操作見文獻(xiàn)[1]

1.6 豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒檢測(cè)

用豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒檢測(cè)的特異性引物，引物資料見文獻(xiàn)[2，3]，以提取并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的基因組cDNA為模板，進(jìn)行病毒的特異性檢測(cè)。RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄按常規(guī)2步法進(jìn)行操作。

1.7 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

以不同日齡段小豬藍(lán)耳病毒以及圓環(huán)病毒抗體水平平均S/P值做散點(diǎn)分布圖，圖中1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)年齡斷小豬的平均抗體水平，并在散點(diǎn)圖中繪出小豬臨床發(fā)病日齡區(qū)間，分析小豬發(fā)病日齡與抗體變化之間的關(guān)系。

1.8 細(xì)菌的分離與鑒定

細(xì)菌分離與鑒定方法見文獻(xiàn)[4]。

2 結(jié)果

2.1 不同日齡段小豬的臨床觀察及解剖、病理學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 臨床表現(xiàn)觀察結(jié)果

通過觀察不同日齡的小豬健康狀況，該豬場(chǎng)小豬在斷奶前，斷奶后的30日齡、50～60日齡臨床表現(xiàn)健康狀況良好，但到70～80日齡則表現(xiàn)出消瘦、皮毛粗亂等明顯的發(fā)病癥狀。具體見圖1、2、3、4。

2.1.2 解剖、病理學(xué)觀察結(jié)果

解剖小豬發(fā)現(xiàn)，發(fā)病早期的小豬內(nèi)臟病理變化，除有肺炎變化外、僅見到腹股溝、腸系膜淋巴結(jié)腫大，其他病變均不明顯；發(fā)病晚期的小豬除外表皮毛粗亂、消瘦外，關(guān)節(jié)可見積液、胸腹腔有纖維素性滲出物、腸系膜淋巴結(jié)明顯腫大，見圖5、6、7。

2.2 藍(lán)耳病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)群體大小選取7份1 4日齡小豬的血液以及3 0、4 0、6 0日齡小豬的血液各8份檢測(cè)藍(lán)耳病毒抗體，由表1可見該豬場(chǎng)小豬1 4日齡時(shí)母源抗體下降，部分小豬藍(lán)耳病毒抗體已變?yōu)殛幮?，沒有藍(lán)耳病毒抗體，但3 0日齡的小豬藍(lán)耳病毒抗體又基本變?yōu)殛栃?，平均S/P值達(dá)到1.1 7，陽性率為8 6%，4 0、6 0日齡的小豬隨日齡增加而抗體水平變得更高，6 0日齡時(shí)抗體水平平均S/P值達(dá)1.7 8，陽性率為1 0 0%。

2.3 圓環(huán)病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)群體大小選取7份1 4日齡小豬的血液，以及3 0、4 0、6 0日齡小豬的血液各8份檢測(cè)圓環(huán)病毒抗體，結(jié)果見表2，由表2可見該豬場(chǎng)小豬1 4日齡時(shí)，小豬圓環(huán)病毒母源抗體仍然較好，平均S/P值為0.9 2，陽性率1 0 0%，到7 0日齡時(shí)已基本轉(zhuǎn)為陰性，少數(shù)個(gè)體圓環(huán)病毒抗體水平達(dá)到了一個(gè)很高的水平，S/P值達(dá)到2.0以上，個(gè)體間抗體水平很不整齊，變異系數(shù)達(dá)到1.7 2的高度。

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2.4 豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒檢測(cè)

用豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒檢測(cè)的特異性引物，以提取的基因組為模板進(jìn)行病毒的特異性檢測(cè)。結(jié)果見圖8、9，由圖8可見只有陽性對(duì)照擴(kuò)增出了232bp的特異性條帶，由圖9可見4份病料有3份擴(kuò)增出了218bp的特異性條帶。

2.5 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)情況

以不同日齡段小豬藍(lán)耳病毒以及圓環(huán)病毒抗體水平平均S/P值做散點(diǎn)分布圖，并在散點(diǎn)圖中繪出小豬臨床發(fā)病日齡區(qū)間，由圖1 0可見在小豬藍(lán)耳病毒抗體轉(zhuǎn)陽后，圓環(huán)病毒抗體轉(zhuǎn)陽過程50～80日齡小豬表現(xiàn)出了明顯的發(fā)病癥狀。

2.6 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

用關(guān)節(jié)腔內(nèi)病變積液及肺臟深部組織接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基和巧克力瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后觀察細(xì)菌生長形態(tài)，結(jié)果兩種培養(yǎng)基均長出了大量相同形態(tài)的細(xì)菌，鮮血瓊脂培養(yǎng)基上有呈β溶血特性；挑取菌落涂片革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果見圖11。由圖11可見大量革蘭氏陽性、兩兩連在一起或呈短鏈的球狀細(xì)菌。以純培養(yǎng)的細(xì)菌為模板，用設(shè)計(jì)的細(xì)菌16SrRNA通用引物擴(kuò)增分離菌株的16SrRNA基因序列，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過BLAST分析表明該細(xì)菌為豬鏈球菌。

3 討論與分析

3.1 由于該豬場(chǎng)沒有給小豬接種藍(lán)耳病毒疫苗，從不同日齡段的小豬群藍(lán)耳病毒抗體變化情況可見，小豬群在14～30日齡階段經(jīng)歷了藍(lán)耳病毒感染，且通過對(duì)5 0～80日齡發(fā)病小豬的病毒檢測(cè)也證明了小豬群中攜帶有藍(lán)耳病毒。但該豬群在14～40日齡階段并未表現(xiàn)出發(fā)病，可能是由于該豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理比較精細(xì)沒有其他病原的繼發(fā)感染，是藍(lán)耳病毒的感染并沒有對(duì)生豬造成較大損害的緣故。

3.2 該小豬群1 4日齡時(shí)，小豬圓環(huán)病毒母源抗體較好，平均S/P值為0.92，陽性率100%。40日齡時(shí)，小豬圓環(huán)病毒抗體出現(xiàn)了陰性個(gè)體，陽性率開始下降，到7 0日齡時(shí)已基本轉(zhuǎn)為陰性，抗體陽性率只有25%，且少數(shù)幾個(gè)抗體陽性的個(gè)體，圓環(huán)病毒抗體達(dá)到了很高的水平，S/P值在2.0以上，應(yīng)該是野毒感染后產(chǎn)生。由于該階段小豬個(gè)體間抗體水平很不整齊，變異系數(shù)在1.72以上，說明該階段小豬群圓環(huán)病毒感染比較活躍。

3.3 根據(jù)藍(lán)耳病毒、圓環(huán)病毒抗體檢測(cè)結(jié)果結(jié)合病原檢測(cè)以及臨床用藥效果情況，可見該次保育舍50～80日齡的10%的個(gè)體出現(xiàn)消瘦，體況變差的現(xiàn)象應(yīng)該主要是由圓環(huán)病毒、藍(lán)耳病毒共同感染造成。至于發(fā)病小豬的關(guān)節(jié)積液、胸腹腔大量滲出物是鏈球菌繼發(fā)感染引起。豬場(chǎng)方采取給小豬接種藍(lán)耳病毒疫苗和圓環(huán)病毒疫苗后使豬病得到了明顯的控制，接種疫苗的小豬沒有再出現(xiàn)類似的發(fā)病表現(xiàn)。該論文說明了小豬群在單一的感染藍(lán)耳病毒的情況下，如果飼養(yǎng)管理到位，動(dòng)物營養(yǎng)水平供應(yīng)均衡、充足，且沒有繼發(fā)感染的情況下很可能不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床發(fā)病表現(xiàn)，但藍(lán)耳病毒與圓環(huán)病毒合并感染則具有協(xié)同致病作用，導(dǎo)致免疫力大幅度下降，很快繼發(fā)一系列并發(fā)癥，出現(xiàn)多系統(tǒng)衰竭綜合征。表現(xiàn)發(fā)熱、拉稀、喘氣、神經(jīng)癥狀等，發(fā)病率和死亡率較高。因此，筆者建議養(yǎng)豬人注意豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理的重要性，在控制藍(lán)耳、圓環(huán)病毒感染的情況下，增強(qiáng)生豬的體質(zhì)、控制其他病原的繼發(fā)感染。以減少盲目使用抗生素帶來的養(yǎng)殖成本增加和病原耐藥性的過度發(fā)展。 □

[1] 葛 猛,屈泰龍,羅維,等.利用圓環(huán)病毒2結(jié)構(gòu)蛋白建立檢測(cè)其抗體的間接ELISA方法[J].2013,(1):63-66.

[2] 向衛(wèi)軍,李潤成,顏運(yùn)秋,等.母豬豬瘟持續(xù)性感染引起仔豬死亡的診斷[J].湖南畜牧獸醫(yī),2009,(3):18.

[3] 李 波,李潤成,肖博仁,等.一例母豬混合感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬丹毒桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷及藥物敏感性實(shí)驗(yàn)[J].豬業(yè)科學(xué)，2011,(8):90-91.

[4] 恭燁,洪厚成,李潤成.斷奶仔豬馬鏈球菌獸疫亞種感染的診斷及防治[J].湖南畜牧獸醫(yī).2012,(2):15-16.