張聰子　童巧珍　郭婷等

摘要：采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)，對(duì)PCR反應(yīng)體系中的5種主要反應(yīng)因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選，確立了適合蛇莓基因組DNA的RAPD和ISSR反應(yīng)體系，RAPD反應(yīng)體系（20 μL）：Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250 μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2 μmol/L、DNA模板60 ng；ISSR反應(yīng)體系（20 μL）：Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250 μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1 μmol/L、DNA模板60 ng。利用確立的體系對(duì)24份蛇莓種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果條帶清晰明亮，多態(tài)性好。

關(guān)鍵詞：蛇莓；RAPD-PCR；ISSR-PCR；單因素；正交設(shè)計(jì)；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S567.201 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0050-04

收稿日期：2013-11-06

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳項(xiàng)目（編號(hào)：10C1029）。

作者簡(jiǎn)介：張聰子（1987—），男，湖北咸寧人，碩士研究生，從事中藥資源研究。

通信作者：童巧珍，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量與資源研究。E-mail：qztong88@126.com。 蛇莓[Duchesnea indica（Andr.）Focke]為薔薇科蛇莓屬植物，為民間常用草藥，具有清熱解毒、消腫散瘀，收斂止血、涼血之功效[1-2]。長(zhǎng)期以來，科研工作者對(duì)蛇莓開展了大量研究，近年來，因發(fā)現(xiàn)蛇莓具有抗腫瘤活性而更加引起學(xué)者們的關(guān)注，蛇莓已成為一種開發(fā)前途廣闊的植物資源。目前，對(duì)蛇莓的研究主要集中在栽培及藥理等領(lǐng)域，分子方面的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)以蛇莓為研究對(duì)象，選擇對(duì)PCR擴(kuò)增體系穩(wěn)定性影響較大的5個(gè)因素，包括模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，以期確立穩(wěn)定適合于蛇莓的 ISSR 及RAPD分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系，為蛇莓的資源鑒定與遺傳多樣性研究提供技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1蛇莓種質(zhì)材料取自湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥植園人工栽培的蛇莓新鮮幼嫩葉片，24組樣本均保存于-70 ℃冰箱中。1-24號(hào)分別為邵陽隆回1號(hào)、邵陽隆回2號(hào)、邵陽隆回3號(hào)、邵陽隆回4號(hào)、邵東、常德1號(hào)、常德2號(hào)、常德澧縣、大圍山1號(hào)、大圍山2號(hào)、平江冬塔、平江幕阜山、平江石漿、平江石漿阜西、衡山、永順西岐、瀏陽周洛、株洲、婁底、長(zhǎng)沙植物園、長(zhǎng)沙市含浦1號(hào)、長(zhǎng)沙市含浦2號(hào)、長(zhǎng)沙望城、長(zhǎng)沙縣。

1.1.2試劑所用試劑均購于北京鼎國(guó)生物公司。RAPD-PCR體系優(yōu)化選用隨機(jī)引物P8，序列為5′-：TCTGGTGAGG-3′；ISSR-PCR體系優(yōu)化選用引物GRD205 824，序列為 5′-（TC）8A-3′。

1.2基因組DNA提取

蛇莓植物基因組DNA采用試劑盒（北京天根）提取，用核酸蛋白測(cè)定儀和l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。將DNA稀釋成20 ng/μL，貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.3PCR擴(kuò)增及凝膠電泳

ISSR擴(kuò)增程序[3]為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存。

RAPD擴(kuò)增程序[4]為94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性 1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸 5 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物均用含有溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠在 0.5×TBE 中電泳，點(diǎn)樣10 μL，電壓4 V/cm，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)拍照。

1.4PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

針對(duì)20 μL反應(yīng)體系中的5個(gè)主要因素Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA濃度，設(shè)定4個(gè)水平，分別建立單因素及正交設(shè)計(jì)表（表1、表2），確立RAPD和 ISSR-PCR 反應(yīng)體系。

1.5退火溫度的優(yōu)化

以上述反應(yīng)體系優(yōu)化確定的5個(gè)因素的最佳濃度水平為基礎(chǔ)，對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。將RAPD退火溫度范圍設(shè)置為30～45 ℃，由梯度PCR儀隨機(jī)生成12個(gè)梯度，分別為30.0、303、31.5、33.0、34.8、36.6、38.4、40.2、42.0、43.5、44.6、45.0℃。

ISSR退火溫度設(shè)置為45.0～61.5 ℃，由梯度PCR儀隨機(jī)生成12個(gè)退火溫度。分別為45.0、45.2、46.1、47.5、49.3、514、53.6、55.8、57.8、59.6、60.8、61.5℃。

1.6ISSR-PCR和RAPD-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

利用上述已建立的ISSR及RAPD反應(yīng)體系，用RAPD隨機(jī)引物P99：5′-GTCCTGGGTT-3′和ISSR引物GRD205835：5′-（TG）8G-3′，對(duì)24份蛇莓材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)已確立的RAPD和ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行驗(yàn)證。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

3討論

當(dāng)前，僅有姚旭麗等采用單因素試驗(yàn)對(duì)蛇莓ISSR-PCR反應(yīng)體系的主要反應(yīng)因子進(jìn)行了優(yōu)化[5]，但尚未開展ISSR和RAPD分子標(biāo)記對(duì)蛇莓種質(zhì)資源的研究，由于該方法并沒有考察因素間的相互作用，物種不同反應(yīng)體系條件也有較大的變化[6]。本試驗(yàn)選擇單因素結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響蛇莓RAPD和ISSR反應(yīng)體系的各個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化，期望得到最佳的PCR反應(yīng)體系。

PCR對(duì)模板DNA濃度、TaqDNA聚合酶要求不高，一般來說，只要提供足夠的模板量（<1 000 ng），1.0～1.5 U（20 μL體系）都會(huì)得到穩(wěn)定的條帶；但2者濃度過高不僅浪費(fèi)還會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物積累[7]。

PCR反應(yīng)條件中影響最大的是Mg2+、dNTPs與引物的濃度[7]，在RAPD-PCR各因素濃度水平互相作用中，高M(jìn)g2+、低dNTPs濃度，以及低Mg2+、高dNTPs濃度條件不能擴(kuò)增出條帶或產(chǎn)生極弱的條帶，因?yàn)閐NTPs過早被消耗完，使產(chǎn)物單鏈化，甚至得不到產(chǎn)物；而過量的dNTPs對(duì)Mg2+的螯合作用明顯，從而降低了依賴于Mg2+的TaqDNA聚合酶的活性，也不能擴(kuò)增出條帶[8-10]；而在ISSR-PCR中，Mg2+濃度太低時(shí)，不管引物和dNTPs濃度如何，均不能成功擴(kuò)增，表明了Mg2+在擴(kuò)增中的重要性。

堿基長(zhǎng)度決定了引物的退火溫度，RAPD中隨機(jī)引物大多為10個(gè)堿基，退火溫度一般為36 ℃，過低會(huì)導(dǎo)致引物與模板非特異性結(jié)合，引起擴(kuò)增的特異性下降[11-12]；但過高，如大于 40 ℃ 時(shí)會(huì)抑制反應(yīng)，導(dǎo)致無片段。ISSR引物大多數(shù)為 15～20個(gè)堿基長(zhǎng)度，比隨機(jī)引物多，適合較高的退火溫度，并且能提高ISSR-PCR反應(yīng)的特異性及精確度。

參考文獻(xiàn)：

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PCR反應(yīng)條件中影響最大的是Mg2+、dNTPs與引物的濃度[7]，在RAPD-PCR各因素濃度水平互相作用中，高M(jìn)g2+、低dNTPs濃度，以及低Mg2+、高dNTPs濃度條件不能擴(kuò)增出條帶或產(chǎn)生極弱的條帶，因?yàn)閐NTPs過早被消耗完，使產(chǎn)物單鏈化，甚至得不到產(chǎn)物；而過量的dNTPs對(duì)Mg2+的螯合作用明顯，從而降低了依賴于Mg2+的TaqDNA聚合酶的活性，也不能擴(kuò)增出條帶[8-10]；而在ISSR-PCR中，Mg2+濃度太低時(shí)，不管引物和dNTPs濃度如何，均不能成功擴(kuò)增，表明了Mg2+在擴(kuò)增中的重要性。

堿基長(zhǎng)度決定了引物的退火溫度，RAPD中隨機(jī)引物大多為10個(gè)堿基，退火溫度一般為36 ℃，過低會(huì)導(dǎo)致引物與模板非特異性結(jié)合，引起擴(kuò)增的特異性下降[11-12]；但過高，如大于 40 ℃ 時(shí)會(huì)抑制反應(yīng)，導(dǎo)致無片段。ISSR引物大多數(shù)為 15～20個(gè)堿基長(zhǎng)度，比隨機(jī)引物多，適合較高的退火溫度，并且能提高ISSR-PCR反應(yīng)的特異性及精確度。

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PCR反應(yīng)條件中影響最大的是Mg2+、dNTPs與引物的濃度[7]，在RAPD-PCR各因素濃度水平互相作用中，高M(jìn)g2+、低dNTPs濃度，以及低Mg2+、高dNTPs濃度條件不能擴(kuò)增出條帶或產(chǎn)生極弱的條帶，因?yàn)閐NTPs過早被消耗完，使產(chǎn)物單鏈化，甚至得不到產(chǎn)物；而過量的dNTPs對(duì)Mg2+的螯合作用明顯，從而降低了依賴于Mg2+的TaqDNA聚合酶的活性，也不能擴(kuò)增出條帶[8-10]；而在ISSR-PCR中，Mg2+濃度太低時(shí)，不管引物和dNTPs濃度如何，均不能成功擴(kuò)增，表明了Mg2+在擴(kuò)增中的重要性。

堿基長(zhǎng)度決定了引物的退火溫度，RAPD中隨機(jī)引物大多為10個(gè)堿基，退火溫度一般為36 ℃，過低會(huì)導(dǎo)致引物與模板非特異性結(jié)合，引起擴(kuò)增的特異性下降[11-12]；但過高，如大于 40 ℃ 時(shí)會(huì)抑制反應(yīng)，導(dǎo)致無片段。ISSR引物大多數(shù)為 15～20個(gè)堿基長(zhǎng)度，比隨機(jī)引物多，適合較高的退火溫度，并且能提高ISSR-PCR反應(yīng)的特異性及精確度。

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