王娜　余晗

摘要：采用剛果紅染色鑒定法，通過(guò)以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源的分離培養(yǎng)基初篩和以桑枝粉為碳源的復(fù)篩培養(yǎng)基復(fù)篩，從桑園地邊垛疊腐爛桑枝下土壤中篩選出1株產(chǎn)纖維素酶的真菌P1，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和對(duì)桑枝的降解能力進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，P1能有效降解桑樹枝條，最適生長(zhǎng)pH值為6，最適生長(zhǎng)溫度為 32 ℃。產(chǎn)生的纖維素酶為復(fù)合酶系，具有濾紙酶（FPAase）、羧甲基纖維素酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶活性。FPAase在發(fā)酵4 d活性最高，可達(dá)10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出現(xiàn)活力高峰，達(dá)18.188 U/mL；CMCase活力變化相對(duì)平緩，4～10 d酶活力變化不大，保持在9～11 U/mL之間。FPAase和CMCase均有較好的溫度和pH適應(yīng)性，在 40～60 ℃ 和pH值4～6的范圍內(nèi)均有較好活性。以CMC-Na為底物時(shí)P1的最大反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）分別為0.082 9 mg/（mL·min）和 0.554 5 mg/mL。基于形態(tài)學(xué)和18S rDNA序列鑒定P1為撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata）。撕裂蠟孔菌是一種典型的木腐菌。該菌株有較好的酶活性和溫度及pH適應(yīng)性，能有效降解桑樹枝條。

關(guān)鍵詞：桑枝；真菌；酶學(xué)特性；降解

中圖分類號(hào)： Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0378-03

收稿日期：2013-10-08

基金項(xiàng)目：江蘇科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新計(jì)劃。

作者簡(jiǎn)介：王娜（1976—），女，山東煙臺(tái)人，碩士，副教授，主要從事生物活性物質(zhì)開發(fā)和利用研究。 E-mail：biojustwn@126.com。纖維素是地球上最為豐富的可再生資源和碳水化合物，占植物界碳素總量的50%以上[1-2]。纖維素是一類線狀大分子物質(zhì)，由葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，由于高度的水不溶性且外圍又被木質(zhì)素包圍，除反芻動(dòng)物瘤胃中的微生物可降解轉(zhuǎn)化少部分纖維素外，大部分纖維素很難降解為可利用的葡萄糖。栽桑養(yǎng)蠶、繅絲織綢是我國(guó)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，作為產(chǎn)業(yè)物質(zhì)基礎(chǔ)的桑樹（Morus alba L.）附屬物桑枝由于高度木質(zhì)纖維化，利用率極低，剪伐后的桑枝和其他纖維素類秸稈一樣大多在田間地頭焚燒，或堆積在地頭任其自然腐爛，不僅浪費(fèi)資源，對(duì)環(huán)境也有不同程度的破壞。雖然桑枝具有較高的營(yíng)養(yǎng)、藥用和工業(yè)價(jià)值[3-5]，在菌類養(yǎng)殖中[6-7]也得到了較好的應(yīng)用，但利用率僅為10%左右。目前，通過(guò)微生物產(chǎn)纖維素酶降解纖維素是最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方法。纖維素酶是指把纖維素降解為纖維素二糖和葡萄糖等小分子可溶性物質(zhì)的一組酶的總稱，主要由3個(gè)主要成分組成[8]。自然界中細(xì)菌、真菌、放線菌等許多生物體中可產(chǎn)生纖維素酶[9]，已報(bào)道的酶菌種就有50多個(gè)屬上千個(gè)菌株[10]，受到酶活性低等因素的限制。篩選活性高、抗逆性好的纖維素酶，已成為微生物學(xué)、環(huán)境保護(hù)科學(xué)、飼料酶制劑工業(yè)等多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)采用剛果紅染色法從桑園周圍的土壤中分離得到1株具有產(chǎn)纖維素酶活性的菌株P(guān)1，通過(guò)形態(tài)學(xué)和18S rDNA分子生物學(xué)鑒定的方法，確定其為撕裂蠟孔菌；并對(duì)菌株降解桑枝過(guò)程中有關(guān)酶特性等進(jìn)行了初步研究，為菌株應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

桑枝：春季剪伐時(shí)收集健壯生長(zhǎng)良好的枝條，剪成5 cm左右小段，50～60 ℃烘箱中烘干，粉碎后過(guò)40目篩，備用。

桑園周圍土壤：采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所（江蘇鎮(zhèn)江），土壤取3處，分別為桑樹根際土壤、桑園地邊垛疊腐爛桑枝下土壤、桑地空隙處土壤。取距土壤表層10 cm左右深處，自然風(fēng)干后研磨成粉，備用。

1.2培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、瓊脂10 g、無(wú)機(jī)鹽溶液 100 mL、水400 mL，pH值7。無(wú)機(jī)鹽溶液（g/L）：MgSO4·7H2O 1.5、（NH4）2SO4 7、KH2PO4 10、CaCl2 1.5、MnSO4·H2O 8.95、FeSO4·7H2O 0.045 7、ZnCl2 0.008 5、CoCl2·6H2O 0018 3。

復(fù)篩培養(yǎng)基：桑枝粉50 g、麥麩皮2 g、瓊脂8 g、無(wú)機(jī)鹽溶液100 mL、水400 mL，pH值7。無(wú)機(jī)鹽溶液（g/L）：NaNO3 25、KH2PO4 10、MnSO4·H2O 3、NaNO2 1、FeCl3 0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基：烘干的5 cm左右長(zhǎng)度桑樹枝條500 g，麥麩皮10 g，按照復(fù)篩培養(yǎng)基配方加入無(wú)機(jī)鹽溶液200 mL，拌勻。

1.3儀器與試劑

儀器：9600型紫外可見分光光度計(jì)、DHZ-D恒溫振蕩搖床、SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)、日本三洋高壓滅菌鍋、蔡司熒光顯微鏡等。試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.4目的菌株的篩選

各取土壤樣品10 g于滅菌三角瓶中，加入100 mL無(wú)菌水，封口后在100 r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩0.5 h。取100 μL該懸浮液均勻涂布在分離培養(yǎng)基上，37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，樣品重復(fù)3次。將長(zhǎng)出的單菌落菌株挑出繼續(xù)接種在固體分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)多次后得純化菌株。將純化菌株點(diǎn)接在分離培養(yǎng)基上24 h，采用剛果紅染色鑒定法[11]染色10～15 min，1 mol/L NaCl溶液洗滌15 min，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈。若有透明圈則初步證明該菌株具有產(chǎn)纖維素酶的能力，透明圈越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。挑選透明圈較大的菌株接種在固體復(fù)篩培養(yǎng)基上，37 ℃下恒溫培養(yǎng)，觀察菌株生長(zhǎng)情況。挑選能有效以桑枝粉為碳源的菌株進(jìn)行系列研究。

1.5粗酶液的制備endprint

取1 L三角瓶，裝入300 mL液態(tài)復(fù)篩培養(yǎng)基（pH值60），滅菌后接入菌株，于32 ℃、110 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。定時(shí)定點(diǎn)取樣，發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.6酶活力測(cè)定

濾紙酶（FPAase）活力測(cè)定參照李振江等的方法[12]，以粉碎的新華濾紙為底物；羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測(cè)定參照Agnihotri等的方法[13]，以CMC-Na為底物；β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定參照周津等的方法[14]，以水楊酸苷為底物。以 1 min 由底物生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.7酶學(xué)特性研究

1.7.1反應(yīng)最適溫度將粗酶液在20、30、40、50、60 ℃的不同溫度條件下，在pH值為4.5 的0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液中反應(yīng)1 h，按照FPAase和CMCase的方法測(cè)定酶活力。

1.7.2反應(yīng)最適pH值分別設(shè)置0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液的pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在最適溫度下反應(yīng) 1 h，按照FPAase和CMCase的方法測(cè)定酶活力。

1.7.3CMCase酶學(xué)動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)底物羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）濃度（[S]）分別為2、3、4、5、6 mg/mL，按 CMCase 活力測(cè)定方法測(cè)定酶促反應(yīng)速率[v，mg/（mL·min）]。用雙倒數(shù)法作圖，以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）為縱坐標(biāo)，計(jì)算出米氏常數(shù)（Km）及最大催化反應(yīng)速率（vmax）[15]。

3結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)剛果紅透明圈法和纖維素酶活性的測(cè)定，從桑園土壤中篩選出1株較為理想的降解桑枝的菌株P(guān)1，在桑樹枝粉為主要碳源的固體復(fù)篩培養(yǎng)基中，菌株能較好生長(zhǎng)。P1為酸性菌，最適生長(zhǎng)溫度在32 ℃，最適生長(zhǎng)pH值為6。

對(duì)該菌纖維素酶活性分析結(jié)果表明，該菌產(chǎn)生的纖維素酶屬于復(fù)合酶系。在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶系中的3種酶活力測(cè)定結(jié)果：P1的濾紙酶活力在4 d時(shí)活性最高，可達(dá)到10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出現(xiàn)活力高峰，達(dá)到 18.188 U/mL；而CMCase活力變化相對(duì)平緩，4～10 d酶活力變化不大。P1產(chǎn)生的FPAase和CMCase均有較好的溫度和pH值適應(yīng)范圍。以CMC-Na為底物，采用雙倒數(shù)作圖法計(jì)算獲得P1的最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km分別為0.082 9 mg/（mL·min）和0.554 5 mg/mL。

P1降解桑樹枝的能力相對(duì)較弱，酶活力較低，但其產(chǎn)纖維素酶具有酶促反應(yīng)條件溫和、范圍廣等優(yōu)良性質(zhì)，有望通過(guò)對(duì)其基因誘變提高產(chǎn)酶能力。

通過(guò)形態(tài)學(xué)和18S rDNA鑒定，確定P1為撕裂蠟孔菌。發(fā)酵試驗(yàn)表明，菌株P(guān)1能夠很好地利用桑枝條，在桑枝條上長(zhǎng)出子實(shí)體，使桑枝條腐爛變黑。參考文獻(xiàn)：

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[14]周津，阮宏，孫連魁. 綠色木霉A10纖維素酶的分離純化及理化性質(zhì)研究[J]. 西北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1994，24（5）：465-469.

[15]王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)發(fā). 生物化學(xué)：下冊(cè) [M].3版. 北京：高等教育出版社，2002：355-367.

[16]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：367-378.endprint

取1 L三角瓶，裝入300 mL液態(tài)復(fù)篩培養(yǎng)基（pH值60），滅菌后接入菌株，于32 ℃、110 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。定時(shí)定點(diǎn)取樣，發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.6酶活力測(cè)定

濾紙酶（FPAase）活力測(cè)定參照李振江等的方法[12]，以粉碎的新華濾紙為底物；羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測(cè)定參照Agnihotri等的方法[13]，以CMC-Na為底物；β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定參照周津等的方法[14]，以水楊酸苷為底物。以 1 min 由底物生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.7酶學(xué)特性研究

1.7.1反應(yīng)最適溫度將粗酶液在20、30、40、50、60 ℃的不同溫度條件下，在pH值為4.5 的0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液中反應(yīng)1 h，按照FPAase和CMCase的方法測(cè)定酶活力。

1.7.2反應(yīng)最適pH值分別設(shè)置0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液的pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在最適溫度下反應(yīng) 1 h，按照FPAase和CMCase的方法測(cè)定酶活力。

1.7.3CMCase酶學(xué)動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)底物羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）濃度（[S]）分別為2、3、4、5、6 mg/mL，按 CMCase 活力測(cè)定方法測(cè)定酶促反應(yīng)速率[v，mg/（mL·min）]。用雙倒數(shù)法作圖，以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）為縱坐標(biāo)，計(jì)算出米氏常數(shù)（Km）及最大催化反應(yīng)速率（vmax）[15]。

3結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)剛果紅透明圈法和纖維素酶活性的測(cè)定，從桑園土壤中篩選出1株較為理想的降解桑枝的菌株P(guān)1，在桑樹枝粉為主要碳源的固體復(fù)篩培養(yǎng)基中，菌株能較好生長(zhǎng)。P1為酸性菌，最適生長(zhǎng)溫度在32 ℃，最適生長(zhǎng)pH值為6。

對(duì)該菌纖維素酶活性分析結(jié)果表明，該菌產(chǎn)生的纖維素酶屬于復(fù)合酶系。在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶系中的3種酶活力測(cè)定結(jié)果：P1的濾紙酶活力在4 d時(shí)活性最高，可達(dá)到10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出現(xiàn)活力高峰，達(dá)到 18.188 U/mL；而CMCase活力變化相對(duì)平緩，4～10 d酶活力變化不大。P1產(chǎn)生的FPAase和CMCase均有較好的溫度和pH值適應(yīng)范圍。以CMC-Na為底物，采用雙倒數(shù)作圖法計(jì)算獲得P1的最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km分別為0.082 9 mg/（mL·min）和0.554 5 mg/mL。

P1降解桑樹枝的能力相對(duì)較弱，酶活力較低，但其產(chǎn)纖維素酶具有酶促反應(yīng)條件溫和、范圍廣等優(yōu)良性質(zhì)，有望通過(guò)對(duì)其基因誘變提高產(chǎn)酶能力。

通過(guò)形態(tài)學(xué)和18S rDNA鑒定，確定P1為撕裂蠟孔菌。發(fā)酵試驗(yàn)表明，菌株P(guān)1能夠很好地利用桑枝條，在桑枝條上長(zhǎng)出子實(shí)體，使桑枝條腐爛變黑。參考文獻(xiàn)：

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[5]牛建設(shè)，喻紅芹，張之亮.桑皮纖維性能與開發(fā)利用現(xiàn)狀的研究[J]. 上海紡織科技，2008，36（6）：19-20.

[6]陸娜，閆靜，周祖法，等. 桑枝屑栽培猴頭菇栽培模式試驗(yàn)[J]. 食用菌，2012（4）：37-38.

[7]姚利娟. 桑枝秀珍菇反季節(jié)高效栽培技術(shù)[J]. 蠶桑通報(bào)，2012，43（3）：56-57.

[8]燕紅，楊謙，王希國(guó). 兩株芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，26（2）：83-86.

[9]謝占玲，吳潤(rùn). 纖維素酶的研究進(jìn)展[J]. 草業(yè)科學(xué)，2004，21（4）：72-76.

[10]王穎. 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選[J]. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30（4）：90-92.

[11]沈雪亮，夏黎明. 產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及酶學(xué)特性研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2002，22（1）：47-51.

[12]李振紅，陸貽通. 高效纖維素降解菌的篩選[J]. 環(huán)境污染與防治，2003，25（3）：133-135，153.

[13]Agnihotri S，Dutt D，Tyagi C H，et al. Production and biochemical characterization of a novel cellulose-poor alkali-thermo-tolerant xylanase from Coprinellus disseminatus SW-1NTCC 1165[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2010，26（8）：1349-1359.

[14]周津，阮宏，孫連魁. 綠色木霉A10纖維素酶的分離純化及理化性質(zhì)研究[J]. 西北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1994，24（5）：465-469.

[15]王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)發(fā). 生物化學(xué)：下冊(cè) [M].3版. 北京：高等教育出版社，2002：355-367.

[16]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：367-378.endprint

取1 L三角瓶，裝入300 mL液態(tài)復(fù)篩培養(yǎng)基（pH值60），滅菌后接入菌株，于32 ℃、110 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。定時(shí)定點(diǎn)取樣，發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.6酶活力測(cè)定

濾紙酶（FPAase）活力測(cè)定參照李振江等的方法[12]，以粉碎的新華濾紙為底物；羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測(cè)定參照Agnihotri等的方法[13]，以CMC-Na為底物；β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定參照周津等的方法[14]，以水楊酸苷為底物。以 1 min 由底物生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.7酶學(xué)特性研究

1.7.1反應(yīng)最適溫度將粗酶液在20、30、40、50、60 ℃的不同溫度條件下，在pH值為4.5 的0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液中反應(yīng)1 h，按照FPAase和CMCase的方法測(cè)定酶活力。

1.7.2反應(yīng)最適pH值分別設(shè)置0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液的pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在最適溫度下反應(yīng) 1 h，按照FPAase和CMCase的方法測(cè)定酶活力。

1.7.3CMCase酶學(xué)動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)底物羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）濃度（[S]）分別為2、3、4、5、6 mg/mL，按 CMCase 活力測(cè)定方法測(cè)定酶促反應(yīng)速率[v，mg/（mL·min）]。用雙倒數(shù)法作圖，以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）為縱坐標(biāo)，計(jì)算出米氏常數(shù)（Km）及最大催化反應(yīng)速率（vmax）[15]。

3結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)剛果紅透明圈法和纖維素酶活性的測(cè)定，從桑園土壤中篩選出1株較為理想的降解桑枝的菌株P(guān)1，在桑樹枝粉為主要碳源的固體復(fù)篩培養(yǎng)基中，菌株能較好生長(zhǎng)。P1為酸性菌，最適生長(zhǎng)溫度在32 ℃，最適生長(zhǎng)pH值為6。

對(duì)該菌纖維素酶活性分析結(jié)果表明，該菌產(chǎn)生的纖維素酶屬于復(fù)合酶系。在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶系中的3種酶活力測(cè)定結(jié)果：P1的濾紙酶活力在4 d時(shí)活性最高，可達(dá)到10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出現(xiàn)活力高峰，達(dá)到 18.188 U/mL；而CMCase活力變化相對(duì)平緩，4～10 d酶活力變化不大。P1產(chǎn)生的FPAase和CMCase均有較好的溫度和pH值適應(yīng)范圍。以CMC-Na為底物，采用雙倒數(shù)作圖法計(jì)算獲得P1的最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km分別為0.082 9 mg/（mL·min）和0.554 5 mg/mL。

P1降解桑樹枝的能力相對(duì)較弱，酶活力較低，但其產(chǎn)纖維素酶具有酶促反應(yīng)條件溫和、范圍廣等優(yōu)良性質(zhì)，有望通過(guò)對(duì)其基因誘變提高產(chǎn)酶能力。

通過(guò)形態(tài)學(xué)和18S rDNA鑒定，確定P1為撕裂蠟孔菌。發(fā)酵試驗(yàn)表明，菌株P(guān)1能夠很好地利用桑枝條，在桑枝條上長(zhǎng)出子實(shí)體，使桑枝條腐爛變黑。參考文獻(xiàn)：

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