張巧玲+楊永強

[摘要] 目的 觀察急慢性髓系白血病患者骨髓單個核細胞β-連環(huán)蛋白的表達及其意義。 方法 41例髓系白血病患者，其中25例急性髓系白血病（AML），16例慢性髓系白血病（CML）。同時選擇18例非惡性血液病患者作為對照。肝素抗凝骨髓2 ml，Ficoll液分離骨髓單個核細胞，熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測β-連環(huán)蛋白的表達。 結果 β-連環(huán)蛋白在AML組表達量明顯高于CML組及對照組（P<0.01）；CML組表達量高于對照組表達量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；CML組4例急變患者的β-連環(huán)蛋白表達量也較高。β-連環(huán)蛋白表達量與患者年齡、性別無關；與骨髓原始細胞含量有關，含量≥30%的患者β-連環(huán)蛋白表達量較高。 結論 β-連環(huán)蛋白在AML和CML急變的患者骨髓單個核細胞中異常高表達，Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在AML和CML急變病例中異常激活可能與白血病細胞的異常增殖有關。

[關鍵詞] 髓系白血??；骨髓單個核細胞；β-連環(huán)蛋白

[中圖分類號] R733.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）07（b）-0004-04

髓系白血?。╩yeloid leukemia，ML）是造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病，分為急性髓系性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）及慢性髓系性白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）。多種癌基因、抑癌基因及其相關基因、凋亡調節(jié)基因的功能異?？蓪е录毎只茏铚?，惡性增殖時機體對細胞免疫監(jiān)視失常，兩方面共同奠定了ML的發(fā)病基礎。許多細胞內信號轉導分子和基因轉錄調節(jié)因子在ML發(fā)病機制中的作用越來越受到重視。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是近年來發(fā)現的一種信號傳導分子，具有參與細胞黏附和介導Wnt信號轉導的雙重功能，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉移密切相關[1-2]，其在ML發(fā)病機制中的作用是目前研究的熱點之一[3-4]。β-連環(huán)蛋白分子在胞質中的異常積累是關鍵環(huán)節(jié)，而蛋白水平的增高涉及其合成的增多與降解的減少，Wnt通路主要在蛋白降解水平上對β-連環(huán)蛋白進行調節(jié)，而對于β-連環(huán)蛋白轉錄水平的研究國內外報道較少。本研究應用實時定量PCR的方法，從mRNA水平研究了β-連環(huán)蛋白在 ML中表達的差異，以探討ML患者Wnt信號途徑下游核轉錄因子β-連環(huán)蛋白與ML預后治療的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗組：2011年5月～2013年5月佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院收治門診和住院的AML及CML患者共41例，其中初治23例，復發(fā)18例；包括AML 25例，CML 16例；男性18例，女性23例；年齡15～79歲，中位年齡39歲。所有患者均經細胞形態(tài)學、組織化學和細胞免疫學檢查，符合ML的診斷指標。

對照組18例，為骨髓涂片大致正常的非惡性血液病患者，其中男性8例，女性10例，年齡19～66歲，中位年齡31歲。

1.2 主要儀器及試劑

C1000 Thermal cycler PCR儀（Bio-Rad公司）、ABI 7300熒光定量儀、Scanspeed 1730R低溫離心機（Labogene 公司），熒光定量PCR試劑、Oligod（T）Primer、Random Primer、DEPC.H2O皆為TaKaRa公司產品。

引物探針設計合成：GenBank上查找目的基因mRNA序列，應用Primer Express 2.0 軟件，在CDS區(qū)設計特異性引物，序列如下：H-b-cat（擴增片段長度98 bp）正向引物：5′-TGATGGTCTGCCAAGTGGGT-3′；反向引物：5′-AAGAGCACAGATGGCAGGCT-3′。H-β-actin（擴增片段長度為106 bp）：正向引物：5′-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3′；反向引物：5′-TC-GTCCCAGTTGGTGACGAT-3′。合成引物探針公司為Invitrogen公司，合成儀器為ABI 3900臺式高通量DNA合成儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 單個核細胞分離 治療前采集患者骨髓2 ml，經肝素抗凝，Ficoll-hypaque密度梯度離心分離單個核細胞（MNC），PBS洗滌后計數，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 全血總RNA的提取 250 μl骨髓單個核細胞液（約5×107個單核細胞）加入1.5 ml離心管中，加入800 μl Trizol振蕩15 s，再加入200 μl氯仿，振蕩15 s，室溫靜置5 min；4℃ 12 000 r/min，離心15 min。取上清液依次用酚氯仿、異丙醇提取，75%乙醇（DEPC水配制）洗滌，加DEPC處理水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 去基因組及總RNA純度檢測 使用RNase-free的DNase Ⅰ（Promega），按以下體系配置100 μl反應液：RNA 20 μl、DNase Ⅰ 20 μl、10×Buffer 10 μl、RNase Inhibitor 0.5 μl、H2O（RNase free）49.5 μl；37℃消化30 min，65℃滅活10 min。然后依次經等體積的苯酚、氯仿、異丙醇常規(guī)處理，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗滌2次，超凈臺風干；加入15～40 μl DEPC水溶解沉淀。純度檢測：取1 μl RNA樣品50倍稀釋，在島津（日本）UV-1750紫外分光光度儀上測定OD值，OD260/OD280在1.8～2.0，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染。

1.3.4 逆轉錄反應 取4 μl RNA模板做逆轉錄反應，儀器為Bio-Rad定性PCR儀（美國），20 μl反應體系如下：5×PrimeScriptTM Buffer （for real time）2 μl、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μl、Oligo dT Primer（50 μmol/L） 1 μl、Random 6 mers（100 μmol/L）2 μl、RNA模板4 μl、無RNA酶水10 μl。反應條件37℃ 15 min，然后85℃ 5 s。

1.3.5 熒光定量PCR反應 待測樣本按以下反應體系進行：10×PCR緩沖液2.5 μl、dNTPs 0.5 μl、Taq 酶0.5 μl、上下引物（10 pmol/μl）各0.5 μl、cDNA 2 μl、H2O 18.5 μl。反應條件為：93℃預變性2 min，然后93℃變性15 s，55℃ 25 s，72℃ 25 s，共40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學處理

相對定量法-CT值的定量方法（CT值是指每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數）：①ΔCT=CT目的基因-CT內參基因；②ΔΔCT=ΔCT-ΔCT最大值；③樣本的相對表達量=2-ΔΔCT

各組間的比較采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包中非參數統(tǒng)計中成組設計的t檢驗（雙側t檢驗），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β-連環(huán)蛋白樣本擴增的結果

β-連環(huán)蛋白樣本擴增的結果間圖1、2。圖1的擴增曲線反映擴增效果良好，圖2的溶解曲線顯示銳利的單一峰，說明試驗設計的反應條件合適，擴增產物均一，無非特異擴增。

2.2 β-連環(huán)蛋白在髓細胞白血病中的表達

β-連環(huán)蛋白在急慢性髓系白血病中均有不同程度的表達（表1），在AML組表達量明顯高于CML組及對照組（P<0.01），5例M4患者β-連環(huán)蛋白表達均>23，最高的為M3病例，達到65.649；CML組表達量高于對照組表達量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），CML組4例急變患者的β-連環(huán)蛋白表達量也較高，分別為19.88、18.24、15.436、17.712。

2.3 β-連環(huán)蛋白基因表達與AML臨床特征的關系

AML骨髓β-連環(huán)蛋白表達量與患者的男女性別之間的差異無統(tǒng)計學意義，在年齡≥60歲或<60歲的表達無關系；在骨髓原始細胞含量>30%的患者組中AML骨髓β-連環(huán)蛋白平均表達量高于原始細胞小于30%的患者組，差異有統(tǒng)計學意義（表2）。

3 討論

Wnts蛋白是一類富含半胱氨酸殘基的分泌性糖蛋白家族，Wnt與細胞表面受體卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關蛋白家族相結合，啟動Wnt通路[5]。在正常和非增殖細胞中缺乏Wnt信號，大部分β-連環(huán)蛋白與上皮鈣黏蛋白一起連接在細胞膜上，小部分游離的β-連環(huán)蛋白也被磷酸化而失活[6]。核內因為沒有Wnt信號傳入，DNA轉錄受到抑制，細胞增殖水平正常。異常情況下，Wnt信號或其他胞外信號刺激導致β-連環(huán)蛋白不能被磷酸化滅活，β-連環(huán)蛋白轉位到胞核中，與轉錄因子TCF/LEF結合轉變?yōu)檗D錄激活劑，特異地啟動下游靶基因如c-myc、c-myb、cyclinD1、ETS等的轉錄和表達，引起細胞增殖加快，抵抗凋亡[7]。β-連環(huán)蛋白在白血病細胞惡性增殖中的作用也不斷被證實[8]。

本研究結果顯示，在急性髓系白血病中β-連環(huán)蛋白普遍異常高表達，在CML急變患者中表達同樣異常增高，而在自身免疫性溶血性貧血、血小板減少癥等良性血液病中呈低表達；β-連環(huán)蛋白表達與患者的年齡、性別關系不大，與原始細胞的數量多少關系密切，提示Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路可能在白血病細胞異常激活，與白血病細胞的惡性增殖有關。王韞秀等[9]的研究結果顯示，在AML的各亞型中M1、M2、M4、M5及M6中β-連環(huán)蛋白呈高表達，而M3中表達量較低；這與本研究結果中M3亞型同樣高表達有所區(qū)別。

近年來關于Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在急慢性白血病中的研究逐漸增多[10]，王焱等[11]通過55例AL患者研究推測Wnt抑制因子1（WIF-1）基因啟動子甲基化及β-連環(huán)蛋白過表達參與了AL患者Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑的異常激活；有報道顯示，Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在CML干細胞中通過調控ABCB1基因參與了多重耐藥作用[12]。Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的作用使得其在白血病治療領域的研究也備受重視[13]，Wang等[14]研究認為，β-連環(huán)蛋白和蛋白激酶B（ATK）抑制劑可作為聯合治療AML的分子靶向藥物。有研究認為，不同的腫瘤細胞對于抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的反應不同，可能導致并不是所有的AML患者都適用于此項定向治療[15]。本研究結果推測Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在AML和CML急變患者中異常激活，可能與白血病細胞的異常增殖有關；而β-連環(huán)蛋白表達量與不同亞型的AL的預后關系如何以及抑制β-連環(huán)蛋白水平對于AL的治療是否有效，都值得進一步探討研究。

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（收稿日期：2014-05-03 本文編輯：林利利）

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（收稿日期：2014-05-03 本文編輯：林利利）