1株阿魏酸降解菌的篩選與降解特征研究

謝 越，馬忠友，孔維芳，李孝良，汪建飛，肖新，馬萬征，鄒海明

(1.安徽科技學(xué)院 a.城建與環(huán)境學(xué)院；b.生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.昆山藍德環(huán)?？萍加邢薰?，江蘇 昆山215331)

1株阿魏酸降解菌的篩選與降解特征研究

謝 越1a，馬忠友1b，孔維芳2，李孝良1a，汪建飛1a，肖新1a，馬萬征1a，鄒海明1a

(1.安徽科技學(xué)院 a.城建與環(huán)境學(xué)院；b.生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.昆山藍德環(huán)?？萍加邢薰荆K 昆山215331)

阿魏酸是導(dǎo)致很多作物產(chǎn)生連作障礙的自毒物質(zhì)。篩選出1株高效降解阿魏酸的細菌，初步鑒定為葡萄球菌屬，命名為AWS4B，研究了AWS4B對阿魏酸的降解特征，探討了其降解途徑。結(jié)果表明，當(dāng)無機鹽培養(yǎng)基中阿魏酸的濃度為100 mg/L時，菌株AWS4B 72 h可降解99.97%。降解過程符合一級動力學(xué)模型，反應(yīng)的活化能Ea為19.88 kJ/mol，降解方程常數(shù)k0為3.26×10-4，得出了菌株AWS4B降解阿魏酸的預(yù)測模型方程。AWS4B降解阿魏酸的底物來源比較廣泛。菌株AWS4B對阿魏酸降解的可能途徑是非氧化脫羧形成香草醛，再氧化形成香草酸，脫甲基后形成原兒茶酸，最后原兒茶酸苯環(huán)裂解后分解為水和二氧化碳，最終實現(xiàn)阿魏酸的降解。

阿魏酸；自毒物質(zhì)；生物降解；降解特征；途徑

阿魏酸是植物的一種化感物質(zhì)，是造成作物連作障礙的重要因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠強烈抑制幼苗根長度，可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素含量以及植株體內(nèi)保護酶活性急劇下降，根系中丙二醛含量增加，造成膜的傷害，從而對作物產(chǎn)生自毒作用[1]。正因為土壤環(huán)境中的阿魏酸具有的生態(tài)毒害作用，關(guān)于阿魏酸的研究已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)環(huán)境的研究熱點之一。對于阿魏酸降解菌的篩選，已有很多學(xué)者做了出色的研究工作。王曉輝等[2]篩選出了降解阿魏酸的3株放線菌，用于降解西瓜根系分泌的阿魏酸，甚至發(fā)現(xiàn)這些放線菌同時具有拮抗西甜瓜枯萎病的雙重功能。陳紅歌等[3]發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌對阿魏酸也有很好的降解作用，該菌與300 mg/L的阿魏酸共培養(yǎng)2 d后，降解率可達99.09%。徐淑霞等[4]的研究結(jié)果與之相似，發(fā)現(xiàn)將黃孢原毛平革菌施入到連續(xù)種植7 a黃瓜的大棚土壤中，阿魏酸在內(nèi)的其他酚酸的降解率達到54.46%，連作土壤施入阿魏酸降解菌對黃瓜連作障礙的解除具有一定的促進作用。

盡管前人對阿魏酸降解菌進行了深入地研究，然而，關(guān)于阿魏酸微生物降解特征尚未明了，尤其是關(guān)于阿魏酸降解菌底物廣譜性、共代謝特征和降解動力學(xué)，以及降解途徑等的研究結(jié)果鮮見報道。筆者從作物多年連作土壤中，篩選出1株高效降解阿魏酸的菌株，研究其對阿魏酸的降解特征和降解途徑，進而揭示該菌株的降解機理，為阿魏酸污染的土壤修復(fù)提供環(huán)境材料和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑與儀器 Waters 600-2487高效液相色譜儀(美國Waters公司)，可變波長紫外檢測器。水相針式過濾器，超純水電阻率為18.2 MΩ·cm-2。Hitachi S-3000N掃描電鏡(日立公司)，1750型紫外-可見分光光度計。酚酸標(biāo)準(zhǔn)樣品：香草酸、香草醛、阿魏酸、原兒茶酸均為分析純試劑(購自Sigma公司)。甲醇、乙腈為色譜純(德國Fisher公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42 g/L，Na2HPO41.3 g/L，F(xiàn)eCl30.5 mg/L，MgSO47H2O 0.5 g/L，pH7.5，121 ℃蒸汽滅菌30 min，即將冷卻時加入阿魏酸100 mg/L，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，瓊脂粉20 g/L，阿魏酸100 mg/L。富集培養(yǎng)基采用無機鹽培養(yǎng)基中加入蛋白胨2 g/L，用于菌劑的平板培養(yǎng)和斜面保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 阿魏酸降解菌篩選 采集連作土壤，采用一次性投加高濃度化合物的馴化方法[5]，從中分離出阿魏酸降解菌，然后逐步減少外加碳源濃度進行馴化，得到能夠以阿魏酸為唯一碳源和能源生長的菌液。經(jīng)過反復(fù)平板涂布，待菌落長好，選取不同形態(tài)的單菌落，重新轉(zhuǎn)至含有100 mg/L阿魏酸的MSM液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)液變渾濁的三角瓶，純化培養(yǎng)3次，低溫冷藏備用。

1.2.2 菌株生理生化特性及其鑒定 菌株接種到無機鹽培養(yǎng)基上，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，高速離心后，棄上清液后加入超純水振蕩混勻，再次離心，重復(fù)3次，收集菌體，冷藏備用。生理生化指標(biāo)檢測與鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》[6]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]和《微生物實驗手冊》[8]中方法。采用平板稀釋涂布法測定培養(yǎng)液中活細菌的數(shù)量，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

阿魏酸降解菌的鑒定采用革蘭氏染色、形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列分析等方法。采用16S rDNA-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S rDNA-R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增篩選的16S rDNA片段。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)，最后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化測序由金斯瑞生物科技有限公司完成。測序結(jié)果利用Genbank上的Blast軟件進行同源性比較，再用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 阿魏酸降解效能的測定 加入菌株懸液至100 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中(下同)，使得250 mL三角瓶中細胞初始濃度為1.4×107CFU/mL(下同)。加入阿魏酸溶液，濃度為100 mg/L，30℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，1、6、12、18、24、36、48、60、72 h測定培養(yǎng)基中阿魏酸濃度和細胞數(shù)量。

1.2.4 降解動力學(xué)研究 在無機鹽培養(yǎng)基中添加阿魏酸，濃度為100 mg/L，調(diào)節(jié)三角瓶溶液中pH為7.0、35 ℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，分別在1、3、6、9、12、24 h后取樣，測定其中阿魏酸的殘留率，然后按照一級動力學(xué)模型擬合。設(shè)置20、30、40 ℃ 3個不同試驗溫度，接菌后1 h后取樣測定培養(yǎng)基中阿魏酸的濃度，計算殘留率。

1.2.5 底物廣譜性試驗 在無機鹽培養(yǎng)基中分別單獨添加葡萄糖、乙酸、香草酸、香草醛、原兒茶酸、苯甲酸、水楊酸和甲苯，每種成分在培養(yǎng)基中的濃度處理分別為25、50、100、200 mg/L 4個濃度梯度，再添加菌株AWS4B，30℃振蕩培養(yǎng)72 h，測定OD600值。

1.2.6 共代謝底物試驗 在含有100 mg/L阿魏酸的無機鹽培養(yǎng)基中分別單獨添加葡萄糖、香草酸、香草醛、原兒茶酸、苯甲酸和水楊酸，每種共代謝底物的濃度均為50 mg/L，再接種菌株AWS4B，分別在1、3、6、9、12、18、24 h后測定其中阿魏酸的殘留率。

1.2.7 阿魏酸殘留率的計算 文中阿魏酸殘留率的計算公式為

殘留率=C/C0×100%

(1)

式中：C為t時刻阿魏酸的濃度，mg/L；C0為初始阿魏酸的濃度，mg/L。

1.2.8 阿魏酸及降解中間產(chǎn)物的測定 培養(yǎng)液經(jīng)10 000 rpm離心后，上清液微孔濾膜過濾后，采用高效液相色譜法測定，色譜條件參照謝越等人的分析方法[9]，即色譜柱為Symmetry C184.6×250 mm，填料直徑為5 μm，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL，A、B雙泵系統(tǒng)，A 為乙腈，B為0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(通過冰醋酸調(diào)至pH 2.8)。梯度洗脫條件：0～10 min，5% A；10～25 min，15% A；25～35 min，40% A；35～40 min，35% A；40～45 min，5% A。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸高效降解菌鑒定

將降解菌馴化、分離純化后，得到1株能降解阿魏酸的細菌，命名為AWS4B。通過平板觀察，該細菌生長相對緩慢，菌落呈金黃色，圓形，直徑2～3 mm，外形光滑濕潤，隆起，邊緣不整齊，易用接種環(huán)挑起。經(jīng)戊二醛固定、干燥、離子濺射金后，在掃描電子顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)菌株為無芽孢桿菌，大小為(0.5～1.0)μm×(1.5～2.0)μm，無鞭毛。革蘭氏染色陽性，化能異養(yǎng)菌，好氧或兼性厭氧，其余生理生化性能見表1。

根據(jù)該菌株的形態(tài)和生理生化反應(yīng)特征，對照《伯杰細菌鑒定手冊》(第九版)[6]，初步鑒定AWS4B為葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)。系統(tǒng)進化樹結(jié)果(圖1)表明，AWS4B與Staphylococcussapro-phyticus(NR-041324)具有99%的同源性，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化結(jié)果，將AWS4B鑒定為葡萄球菌屬細菌。

表1 菌株AWS4B的生理生化指標(biāo)檢測

注：+為陽性反應(yīng)；-為陰性反應(yīng)。

圖1 菌株AWS4B基于16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2 菌株AWS4B對阿魏酸的降解效能

菌株AWS4B可以利用阿魏酸為唯一碳源和能源生長，其對阿魏酸的降解效能見圖2，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在阿魏酸初始濃度為100 mg/L條件下，菌株AWS4B在12 h時，降解了14.86%，然后降解速率迅速增加，24 h時已降解77.32%， 此后降解速率緩慢下降，至48 h時，殘留率已達98.91%，至72 h時，已達99.97%，由此可見，菌株AWS4B在48 h之內(nèi)基本上可以將阿魏酸降解完畢。與之相呼應(yīng)，菌株AWS4B的密度也隨著阿魏酸的殘留率的降低而呈現(xiàn)相反的變化趨勢，在試驗開始的前6 h內(nèi)，菌體密度基本維持在107CFU/mL范圍內(nèi)，隨著阿魏酸殘留率的減少，菌株AWS4B菌體密度急劇增加，36 h后菌體密度已超過108CFU/mL，72 h時已接近109CFU/mL。阿魏酸殘留率的迅速降低伴隨著菌體密度的同步增加，這說明AWS4B菌株對阿魏酸具有高效降解能力。

圖2 以阿魏酸為唯一碳源菌株AWS4B的生長和阿魏酸降解曲線

2.3 菌株AWS4B對阿魏酸降解動力學(xué)

以接菌后1 h為起始值，以阿魏酸殘留率對數(shù)的負值-ln(C/C0)(C0為初始阿魏酸的濃度，C為t時刻阿魏酸濃度)對培養(yǎng)時間t作圖(見圖3)。分別進行線性回歸，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3個不同溫度下降解動力學(xué)方程具有良好相關(guān)性，其擬合相關(guān)系數(shù)R2分別為0.990 4、0.995 1和0.990 8，因此，可以判斷菌株AWS4B對阿魏酸降解過程符合動力學(xué)模型中的指數(shù)模型，屬于一級反應(yīng)，按照一級動力學(xué)方程[10]

圖3 菌株AWS4B對阿魏酸的降解動力學(xué)

-d[Q]/dt=k[Q]n

(2)

ln[Q]=-kt+ln[Q0]

(3)

式中：[Q0]為阿魏酸的初始濃度。

阿侖烏斯(Arrheius)認(rèn)為反應(yīng)的速率常數(shù)k與反應(yīng)溫度T之間存在以下關(guān)系：

k=k0×exp(-Ea/RT)

(4)

式中：k0為方程常數(shù)；Ea為反應(yīng)活化能，kJ/mol；R為氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；T為絕對溫度，K。

根據(jù)式(2)和(4)推導(dǎo)并積分可得到

[Q]=k0×exp(-Ea/RT)×t

(5)

由式(2)可以得到不同溫度下的降解反應(yīng)常數(shù)k，然后，再根據(jù)不同溫度下的k值，用lnk對1/T作線性回歸，通過式(4)得到直線的斜率為-Ea/R，截距為lnk0，再由直線的斜率就可以求出活化能Ea，具體動力學(xué)參數(shù)見表2。

表2 菌株AWS4B降解阿魏酸動力學(xué)參數(shù)

將式(5)變形為

(6)

將活化能Ea=19.88 kJ/mol，常數(shù)k0=3.26×10-4和R=8.314 J/(mol·K)代入式(6)得到

(7)

式(7)即為菌株AWS4B降解阿魏酸的預(yù)測模型。

2.4 菌株AWS4B底物廣譜性試驗

在無機鹽培養(yǎng)基中分別單獨添加不同的有機物作為菌株AWS4B的唯一碳源，振蕩培養(yǎng)72 h，菌株AWS4B在不同底物OD600值見表3。從表中可以發(fā)現(xiàn)，在選用的各種底物中，菌株AWS4B除了不能在甲苯和乙酸中生長外，均能利用其余6種底物作為唯一碳源和能源。其中在葡萄糖、香草酸、香草醛、原兒茶酸和苯甲酸這些底物培養(yǎng)中，在4個濃度梯度中能夠良好生長，各濃度之間沒有明顯區(qū)別。菌株AWS4B在利用水楊酸這種底物時，在200 mg/L處理濃度條件下菌液OD600值明顯比25 mg/L下降較多，這可能是由于菌株AWS4B不能適應(yīng)這種底物的高濃度條件，生長狀況下降導(dǎo)致的。而菌株AWS4B在苯甲酸在4個濃度梯度中，似乎適應(yīng)較好，甚至在200 mg/L的高濃度時，OD600值明顯上升。菌株AWS4B能夠分別以葡萄糖、香草酸、香草醛、原兒茶酸和苯甲酸這6種底物作為唯一碳源和能源，這說明AWS4B底物的來源具有一定的廣譜性。

表3 菌株AWS4B在不同底物處理中的OD600值

2.5 不同共代謝底物對降解效果的影響

如圖4所示，研究發(fā)現(xiàn)分別單獨加入葡萄糖、苯甲酸、水楊酸3種底物后，對菌株AWS4B降解阿魏酸幾乎沒有任何明顯影響，和對照組相似，基本上都能夠在25 min內(nèi)完成阿魏酸的降解，這說明菌株AWS4B在降解阿魏酸的同時，可以分別共代謝葡萄糖、苯甲酸、水楊酸3種底物。然而，在單獨加入香草醛、香草酸和原兒茶酸3種底物后，在相同的時間內(nèi)，阿魏酸的殘留率均明顯高于對照以及單獨添加葡萄糖、苯甲酸和水楊酸3種底物的處理，這說明分別單獨添加香草醛、香草酸和原兒茶酸3種底物，在一定程度抑制了菌株AWS4B對阿魏酸的降解。

圖4 不同共代謝底物對阿魏酸降解的影響

2.6 菌株AWS4B對阿魏酸的降解途徑

前面的試驗結(jié)果顯示，菌株AWS4B既能夠利用香草醛、香草酸和原兒茶酸作為唯一碳源和能源，但在共代謝過程中又會對阿魏酸的降解產(chǎn)生抑制作用。眾所周知，當(dāng)往化學(xué)反應(yīng)中添加反應(yīng)產(chǎn)物時，會產(chǎn)生抑制該反應(yīng)的正向進行，因此，有理由推測共代謝中抑制阿魏酸降解的原因，有一種可能是由于在菌株AWS4B降解阿魏酸的過程中，產(chǎn)生了香草醛、香草酸和原兒茶酸這3種中間代謝產(chǎn)物。為了驗證這個假設(shè)，試驗分析了培養(yǎng)12 h后的樣品中的成分，并與標(biāo)準(zhǔn)樣品對照，通過保留時間進行定性分析，結(jié)果見圖5，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)12 h后的樣品中除了尚未降解的阿魏酸之外，還存在香草醛、香草酸和原兒茶酸這3種物質(zhì)，而對照樣品中只發(fā)現(xiàn)阿魏酸的存在，這說明上述3種物質(zhì)的確是阿魏酸在被菌株AWS4B降解過程中產(chǎn)生的中間代謝物質(zhì)。

圖5 菌株AWS4B降解阿魏酸中間產(chǎn)物的高效液相色譜分析

文獻報道微生物降解阿魏酸有7類途徑[11]，其中之一是阿魏酸可以非氧化脫羧形成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，然后可形成香草醛，氧化后形成香草酸。茄病鏈孢[12]、宛氏擬青霉[13]和凝結(jié)芽孢桿菌[14]就是通過這條路徑降解阿魏酸的。產(chǎn)生的香草酸會繼續(xù)降解，其降解途徑又可分為4類，其中一類降解方式是香草酸脫甲基后形成原兒茶酸，然后原兒茶酸通過苯環(huán)裂解最終分解為水和二氧化碳。假單胞菌菌株HR199[15]、惡臭假單胞菌[16]和一些放線菌[17]就能通過該途徑降解香草酸。綜上所述，綜合各種降解阿魏酸的路徑，再結(jié)合試驗結(jié)果，推斷菌株AWS4B是通過非氧化脫羧形成香草醛，再氧化形成香草酸，脫甲基后形成原兒茶酸，最后原兒茶酸苯環(huán)裂解后分解為水和二氧化碳，最終實現(xiàn)阿魏酸的降解。

3 結(jié)論

1)從連作土壤中分離得到1株高效降解阿魏酸的細菌，命名為AWS4B，鑒定為葡萄球菌屬細菌。該菌可以利用阿魏酸作為唯一碳源和能源，搖瓶培養(yǎng)72 h，99.97%的阿魏酸可被降解。

2)菌株AWS4B對阿魏酸的降解符合一級動力學(xué)模型，反應(yīng)的活化能Ea為19.88 kJ/mol，降解方程常數(shù)k0為3.26×10-4。

3)菌株AWS4B能夠利用葡萄糖、香草酸、香草醛、原兒茶酸、苯甲酸和水楊酸在內(nèi)的6種底物作為唯一碳源，底物來源具有一定程度的廣譜性。在100 mg/L阿魏酸存在的情況下，香草醛、香草酸和原兒茶酸3種共代謝底物對菌株AWS4B有抑制作用。

4)菌株AWS4B對阿魏酸可能的降解途徑是通過非氧化脫羧形成香草醛，再氧化形成香草酸，脫甲基后形成原兒茶酸，最后原兒茶酸苯環(huán)裂解后分解為水和二氧化碳，最終實現(xiàn)阿魏酸的降解。

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(編輯 王秀玲)

FerulicAcidDegradationBacteriumAWS4BScreeningandItsDegradationCharacteristics

XieYue1a，MaZhongyou1b，KongWeifang2，LiXiaoliang1a，WangJianfei1a，XiaoXin1a，MaWanzheng1a，ZouHaiming1a

(1a. College of Urban Construction and Environment; 1b. College of Life Sciences, Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100, Anhui, P. R. China; 2. Kunshan Land Environment Protection Technology, Kunshan 215331, Jiangsu, P. R. China)

Ferulic acid(FA)was one of important auto-toxic chemicals leading to continuous cropping obstacle for many crops. A bacterium strain AWS4B was screened out and identified preliminarily as Staphylococcus sp.,named as AWS4B. The degradation characteristics was studied and the pathway of the degradation was discussed. The results showed that the degradation rate reached 99.97% in 72 h when the initial FA concentration in the inorganic salt urbane liquor was 100 mg/L. The degradation of FA followed first-order reaction kinetics model and the thermal degradation activation energy was 19.88 kJ/molThe rate constant(k0)was 3.26×10-4and equation for strain AWS4B prediction model was proposed in this paper. Many compounds provide strain AWS4B with carbon and enery. The influence of different nutrient substrates added in the degradation experiments was also investigated. Degradation pathway was likely to be that FA was degraded into Vanillin, Vanillic acid and protocatechuic acid through non-oxidative decarboxylation, oxidation and demethylation.The protocatechuic acid was depredated through benzene ring cleavage and water and carbon dioxide were produced finally and FA was degraded by strain AWS4B.

Ferulic acid; auto-toxic chemical; biodegradation; degradation characteristics; pathway

10.11835/j.issn.1674-4764.2014.06.018

2014-05-20

國家自然科學(xué)基金(31101598)；安徽科技學(xué)院引進人才項目(ZRC2012320)；安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2012A067、KJ2012Z068)；安徽省高校自然基金(KJ2013Z056)

謝 越(1980-)，男，博士，主要從事農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究，(E-mail)xiey@ahstu.edu.cn。

X172

A

1674-4764(2014)06-0106-06