于艷艷，丁 甜，劉東紅

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058)

嗜冷菌是指在7℃及以下可生長(zhǎng)的微生物［1］，其種類繁多，在原料乳中最常見的嗜冷菌是革蘭氏陰性的假單胞菌屬(Pseudomonas)和革蘭氏陽性的桿菌屬(Bacillus)。嗜冷菌對(duì)原料乳品質(zhì)和貨架期有很大影響，擠奶設(shè)備的不徹底清洗和消毒被認(rèn)為是引起嗜冷菌污染的主要原因之一［2］。雖然嗜冷菌在巴氏殺菌和UHT滅菌階段能夠被完全殺死，但是其在生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生了熱穩(wěn)定性的蛋白酶和脂肪酶，這些酶在熱處理之后仍能殘留一定活性，在乳制品儲(chǔ)藏過程中不斷分解蛋白質(zhì)和脂肪，最終導(dǎo)致乳制品出現(xiàn)苦味、腐爛味等風(fēng)味異常［3］。此外，某些嗜冷菌屬能夠產(chǎn)生毒素或者具有抗藥性而被認(rèn)為是機(jī)會(huì)致病菌［4］。因此，嗜冷菌污染是影響乳品工業(yè)發(fā)展的重要因素，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)原料乳中嗜冷菌含量對(duì)提高乳制品品質(zhì)，加強(qiáng)企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益有戰(zhàn)略意義。

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中嗜冷菌的測(cè)定方法是將原料乳在6.5℃下培養(yǎng)10d計(jì)數(shù)，該方法能夠準(zhǔn)確計(jì)數(shù)但是耗時(shí)過長(zhǎng)。隨著微生物技術(shù)的不斷發(fā)展，化學(xué)方法、免疫技術(shù)、分子基因技術(shù)、物理方法等技術(shù)被應(yīng)用到微生物的快速檢測(cè)中，其中大都適用于乳制品微生物的檢測(cè)。這些新興技術(shù)的出現(xiàn)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，為乳制品企業(yè)及時(shí)有效地了解乳中嗜冷菌含量提供了依據(jù)。

1 嗜冷菌快速檢測(cè)方法

國(guó)內(nèi)外對(duì)嗜冷菌的快速檢測(cè)建立了許多方法(見表1)，這些方法不斷被優(yōu)化改進(jìn)以求達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用的目的。然而剛采集的新鮮原料乳中初始嗜冷菌占細(xì)菌總數(shù)的10%～50%，在低溫冷藏過程中再逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位［5］。一些快速檢測(cè)方法(如氨肽酶法、電阻抗法、ELISA、QCM等)檢測(cè)閾值較高，菌數(shù)達(dá)到104cfu/mL以上才能被檢出，不能第一時(shí)間得到新鮮生乳中的嗜冷菌含量。DEFT法近些年來少有報(bào)道，且在103cfu/mL以上才有較好線性關(guān)系。而脂肪酶活法受到乳中游離脂肪酸等因素影響，與嗜冷菌的相關(guān)性仍有待研究。

因此，本文將重點(diǎn)介紹其中幾種近些年來發(fā)展較快，低檢測(cè)閾值且快速省時(shí)的嗜冷菌檢測(cè)技術(shù)。

1.1 實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量 PCR(Real－timeQuantitative Polymerase Chain Reaction，RQ－PCR)是在常規(guī) PCR體系中加入熒光染料或熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR反應(yīng)過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和累加熒光信號(hào)的同步分析，從而克服了傳統(tǒng)PCR只能基于凝膠電泳定性判斷的缺點(diǎn)。很多研究表明該方法檢測(cè)限與平板計(jì)數(shù)法相近，例如對(duì)原料乳中類芽孢桿菌屬(Paenibacillus spp.)定量分析，其檢測(cè)限約為3.25 ×101cfu/mL［12］;而對(duì)污染奶樣中單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的 PCR 定量檢測(cè)限可達(dá)1.58 ×103cfu/mL［13］。

表1 主要幾種嗜冷菌快速檢測(cè)技術(shù)Table 1 Several major rapid detection methods of psychrophilic bacteria

目前RQ－PCR趨于更加節(jié)約時(shí)間和成本，在單一反應(yīng)中進(jìn)行復(fù)合 PCR擴(kuò)增成為研究趨勢(shì)［14］。Machado等人［15］針對(duì)不同目標(biāo)基因設(shè)置了各自的特異性引物，對(duì)原料乳中不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，熒光假單孢菌屬(P.fluorescens)，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和沙雷氏菌(Serratia)進(jìn)行復(fù)合PCR探索分析，凝膠電泳結(jié)果可清晰區(qū)分4條不同長(zhǎng)度的DNA鏈，表明在原料乳中同時(shí)檢測(cè)這四種細(xì)菌的可操作性。實(shí)時(shí)的復(fù)合PCR技術(shù)通常采用含有不同熒光素的特異性探針在擴(kuò)增時(shí)進(jìn)行同步監(jiān)測(cè)，而熒光染料不能特異性區(qū)分不同DNA片斷，需通過后續(xù)的融化曲線分析來克服此問題［16］。Omiccioli等人［17］比對(duì)了熒光探針復(fù)合PCR和融化曲線分析兩種方法來同時(shí)檢測(cè)奶樣中沙門氏菌(Salmomella spp.)、單增李斯特菌和大腸桿菌O157(Escherichia coli O157)，結(jié)果顯示雖然熒光探針復(fù)合PCR在檢測(cè)培養(yǎng)基樣品時(shí)更為靈敏，但兩種方法在對(duì)奶樣檢測(cè)時(shí)達(dá)到了同樣的檢測(cè)限:1cfu/125mL。這種技術(shù)的出現(xiàn)為原料乳中多種優(yōu)勢(shì)嗜冷菌屬的同步檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，比對(duì)單一菌屬的測(cè)定來反映嗜冷菌總數(shù)更具準(zhǔn)確性。

但是RQ－PCR無法區(qū)分樣品中的DNA是來自活細(xì)胞還是死細(xì)胞。目前的解決方式是在DNA提取和擴(kuò)增前先加入一種染料［18］，在該技術(shù)中染料EMA或PMA只能進(jìn)入死細(xì)胞破壞其細(xì)胞完整性和DNA結(jié)構(gòu)，從而抑制死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增。

1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop－mediated Isothermal Amplification，LAMP)是針對(duì)目的基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四條特異性引物，利用一種具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下反應(yīng)幾十分鐘快速擴(kuò)增靶序列［19］。與PCR技術(shù)相比，這種技術(shù)不需要專用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，在簡(jiǎn)單的加熱儀器中就能進(jìn)行，并且由于四條引物必須與六個(gè)靶基因準(zhǔn)確雜交才能開始DNA合成，因此該技術(shù)具有極高的特異性［20］，例如Wang［21］等采用LAMP技術(shù)對(duì)原料乳中單增李斯特菌的檢測(cè)，且在沒有增菌培養(yǎng)的情況下與標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)一致性高達(dá)91.67%，經(jīng)過增菌處理后能達(dá)100%一致性。

研究表明，在DNA合成階段產(chǎn)生的焦磷酸鎂衍生物沉淀所引起的體系濁度變化與目標(biāo)基因的擴(kuò)增數(shù)呈線性關(guān)系［22］，因此可以通過監(jiān)控體系的濁度變化來間接推算樣品中目標(biāo)基因的含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中菌數(shù)的定量分析。Shan等［23］就使用實(shí)時(shí)濁度分析儀定量檢測(cè)了食品中單增李斯特菌的hlyA基因，得到濁度閾值和菌濃度對(duì)數(shù)值之間的線性相關(guān)性為0.991，其最低檢測(cè)限可達(dá)6cfu/管。此外，微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)使LAMP技術(shù)的操作變得更為便捷省時(shí)。Tourlousse［24］使用這種技術(shù)成功檢測(cè)到了沙門氏菌、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)等4種菌屬的目的基因，并在體系中加入了熒光染料，通過熒光分析儀的實(shí)時(shí)監(jiān)控同樣達(dá)到了對(duì)菌數(shù)定量檢測(cè)的目的，該反應(yīng)能在20min內(nèi)檢測(cè)到每1μL中10～100個(gè)基因的濃度，這種微流控芯片結(jié)合實(shí)時(shí)熒光分析設(shè)備的低成本復(fù)合體系將來可能成為現(xiàn)場(chǎng)嗜冷菌快速檢測(cè)的重要方式之一。

當(dāng)然，這種靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短的技術(shù)也存在一定缺點(diǎn):由于LAMP是鏈置換合成，一般建議其擴(kuò)增區(qū)域距離為120～180bp，超過500bp的長(zhǎng)鏈靶序列則難以擴(kuò)增。

1.3 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術(shù)(FluorescenceInSitu Hybridization，F(xiàn)ISH)是通過已知外源的熒光標(biāo)記寡核苷酸作為探針，基于堿基互補(bǔ)原則，與待檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶序列專一性結(jié)合，通過檢測(cè)雜交位點(diǎn)的熒光信號(hào)來對(duì)特定核苷酸序列進(jìn)行定性、定量和定位分析［25］。與前兩種技術(shù)不同的是，F(xiàn)ISH不需要核酸提取或擴(kuò)增的過程，因而被認(rèn)為是快速檢測(cè)食品中微生物的重要方法之一。牛奶中嗜冷菌屬檢測(cè)方面，Kitaguchi［26］等人使用 16s rRNA 的寡核苷酸探針結(jié)合CTC染料染色在6h內(nèi)檢測(cè)牛奶中假單胞菌屬，與實(shí)際菌數(shù)的相關(guān)性可達(dá)0.99，該方法采用熒光顯微鏡人工計(jì)數(shù)，較為耗時(shí)耗力，引入自動(dòng)化的圖像分析儀器更有助于實(shí)驗(yàn)的快速進(jìn)行［27］。另一方面，肽核酸探針比寡核苷酸探針的雜交速度更快［26］，例如采用Lac663肽核酸探針檢測(cè)牛奶中乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)時(shí)大約需要 3h［28］，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

隨著 FISH的發(fā)展，多色熒光原位雜交技術(shù)(multicolor fluorescence in situ hybridization)逐漸被應(yīng)用到食品中不同菌屬的同步檢測(cè)中，這種技術(shù)可利用不同熒光素標(biāo)記的DNA探針對(duì)不同靶DNA同時(shí)進(jìn)行分析。Yamaguchi［29］等人使用該技術(shù)在7h內(nèi)完成了牛奶中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和假單胞菌屬的選擇性分析，他們結(jié)合一種小菌落計(jì)數(shù)的方法，快速測(cè)定樣品中目標(biāo)細(xì)菌，得到了與平板計(jì)數(shù)法幾乎一致的結(jié)果，其檢測(cè)閾值可達(dá)2×103cells/mL，這為利用FISH技術(shù)在牛奶中復(fù)合檢測(cè)多種嗜冷菌屬提供了思路。

FISH技術(shù)也存在一定的缺點(diǎn)，例如在染色體含量較低的情況下，熒光信號(hào)的減弱會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此要通過某些標(biāo)記如生物素等來增強(qiáng)熒光信號(hào)。此外，雜交探針的設(shè)計(jì)也十分關(guān)鍵，特異性不足會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是以流式細(xì)胞儀為工具，將懸浮液中的待測(cè)細(xì)胞熒光染色后，被染色細(xì)胞受強(qiáng)激光照射，產(chǎn)生光信號(hào)，經(jīng)一系列光電分析器接收分析后轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)信號(hào)［30］。這種技術(shù)同樣不需要DNA的提取和擴(kuò)增過程，且具有快速、靈敏、分析量大等優(yōu)點(diǎn)，在乳制品微生物的快速檢測(cè)中有著良好的應(yīng)用。研究表明這種技術(shù)與傳統(tǒng)平板法之間具有較好的相關(guān)性:Cassoli［31］等對(duì)原料奶中細(xì)菌總數(shù)的研究結(jié)果顯示奶樣低溫儲(chǔ)藏24、48和72h后兩種方法的相關(guān)性分別大于0.82、0.87和0.91，并且不同時(shí)段采集的奶樣對(duì)結(jié)果沒有影響。與此同時(shí)，在奶制品中特定菌屬的檢測(cè)中，F(xiàn)lint［32］使用BactiFlow流式細(xì)胞儀檢測(cè)了奶粉中嗜熱菌的含量，樣品經(jīng)去除干擾因子，55℃保溫等處理后檢測(cè)結(jié)果和與平板培養(yǎng)法的相關(guān)系數(shù)可高達(dá)0.9748，可見兩種方法得到的結(jié)果已十分相近，其最低檢測(cè)限為103cfu/g。

此外，將流式細(xì)胞技術(shù)與其他一些高新技術(shù)結(jié)合也可得到很好的效果。Yamaguchi［33］等采用了一種微流體裝置——芯片流體分析并結(jié)合原位雜交技術(shù)來特異性檢測(cè)牛奶中假單胞菌屬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能檢測(cè)到少于10cfu/mL的菌濃度，靈敏度高于平板培養(yǎng)。該方法需要約12h的增菌培養(yǎng)過程，總檢測(cè)時(shí)間大約16h。Ikeda［34］等采用類似的方法測(cè)定牛奶中的李斯特菌數(shù)，其檢出限為102cfu/mL，檢測(cè)時(shí)間僅為5h。

FCM檢測(cè)也受到多種因素的影響。由于乳中蛋白質(zhì)、脂肪球等大顆粒物質(zhì)的存在，會(huì)干擾流式細(xì)胞儀對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的定位，因此在乳品分析時(shí)首先將這些物質(zhì)清除。此外，熒光染料的選擇、細(xì)菌種類、細(xì)胞著色過程等也對(duì)其精度有一定影響。

1.5 ATP生物發(fā)光技術(shù)

ATP生物發(fā)光技術(shù)(Adenosine Triphosphate Bioluminescence)是將熒光素和微生物體內(nèi)ATP在熒光素酶E和Mg2+的作用下形成復(fù)合體，該復(fù)合體被分子氧氧化發(fā)生電激發(fā)，最后發(fā)射光［35］。由于一定生理時(shí)期的微生物體內(nèi)ATP的含量是相對(duì)穩(wěn)定的，而光信號(hào)與ATP量成正比，通過測(cè)定光信號(hào)就能得到ATP含量。這種方法能在幾分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，且靈敏度高，重復(fù)性好，可作為食品工業(yè)中一般危害分析和 HACCP 的一部分［36］。

初始采用ATP生物發(fā)光法對(duì)原料乳中細(xì)菌數(shù)檢測(cè)時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)平板法的相關(guān)性較低，這是由于乳中一些非微生物ATP(體細(xì)胞ATP、酪蛋白膠束上的游離ATP)的存在會(huì)干擾ATP檢測(cè)的精度，一些學(xué)者就通過一些前處理手段破壞這些非微生物ATP。李春艷［37］等在反應(yīng)體系中添加了體細(xì)胞裂解液，該方法與平板培養(yǎng)法之間的相關(guān)系數(shù)提高到0.9485。Wu［38］則通過二次離心和三磷酸腺苷雙磷酸酶預(yù)處理來降低液態(tài)益生菌產(chǎn)品中其他物質(zhì)的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)去除了這些干擾因子，ATP生物發(fā)光法與平板培養(yǎng)法之間沒有顯著差別，該方法能在30min內(nèi)完成檢測(cè)，其最低檢測(cè)限為103cfu/mL。

目前一些研究趨于將ATP生物發(fā)光技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合以達(dá)到特異性檢測(cè)某些菌屬的目的。例如Cheng等［39］用生物磁性納米微粒(BMNPs)與ATP生物發(fā)光技術(shù)結(jié)合快速檢測(cè)巴氏殺菌乳中大腸桿菌含量。BMNPs的作用在于特異性結(jié)合到大腸桿菌表面使之輕易從樣品中分離。該方法能在1h內(nèi)完成檢測(cè)，其檢測(cè)限為20cfu/mL。這種快捷且具有特異性的方式為ATP生物發(fā)光技術(shù)特應(yīng)用到特異性檢測(cè)乳中優(yōu)勢(shì)嗜冷菌中指明了新的方向。

2 展望

嗜冷菌的快速檢測(cè)技術(shù)為乳制品企業(yè)及時(shí)了解原料乳中嗜冷菌污染情況提供了有力幫助，這些反應(yīng)靈敏、能檢測(cè)到低濃度菌含量的高新技術(shù)更是拓寬了檢測(cè)信息的廣度。實(shí)時(shí)定量PCR、LAMP、FISH等技術(shù)雖然只能檢測(cè)一種或幾種菌群，但對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的定量分析能快速判斷嗜冷菌的污染情況。流式細(xì)胞術(shù)能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣的處理，滿足現(xiàn)場(chǎng)大量樣品的檢測(cè)需求。ATP生物發(fā)光法是一種即時(shí)反應(yīng)技術(shù)，能迅速得到結(jié)果。然而這些技術(shù)大都成本較高，且在提取目標(biāo)物、設(shè)計(jì)引物等技術(shù)上比較繁復(fù)，在投入工業(yè)化使用的過程中存在一定的局限性，還需要在技術(shù)及設(shè)備上加強(qiáng)改進(jìn)。

當(dāng)前我國(guó)乳品安全是社會(huì)公眾關(guān)注的熱點(diǎn)話題，確保原料的安全衛(wèi)生是乳制品企業(yè)收獲更好的經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵之一，這為原料乳快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了良好的契機(jī)。然而一些方法能在實(shí)驗(yàn)室得到很好的結(jié)果但未必適合工業(yè)化的應(yīng)用，一種好的嗜冷菌檢測(cè)技術(shù)應(yīng)當(dāng)具備靈快速、靈敏度高且成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，能在工廠環(huán)境下實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，這就需要在成熟的技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)相應(yīng)操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)設(shè)備，類似微流控芯片的出現(xiàn)。隨著現(xiàn)代技術(shù)的不斷發(fā)展以及對(duì)工業(yè)化技術(shù)應(yīng)用的不斷改進(jìn)，原料乳中嗜冷菌的快速檢測(cè)技術(shù)也能進(jìn)一步朝著這樣的方向發(fā)展。

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