叢智榮，劉 紅，徐小紅，江 棋，沈 茜，曹永峰，倪靜怡

(1.江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院 內(nèi)科，江蘇 南通，226361; 2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，江蘇 南通，226001)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的一種非霍奇金淋巴瘤(non-NHL)，約占NHL的35%～40%。研究[1-2]表明，DLBCL是一組在臨床表現(xiàn)、組織學(xué)形態(tài)、免疫表型、治療反應(yīng)及預(yù)后等方面具有較大異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。其發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞周期調(diào)控機制的失控在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。Ki-67是一種非組蛋白性核蛋白，其與腫瘤分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移及生存預(yù)后等關(guān)系密切，故Ki-67的表達可作為反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志，用來評估腫瘤生長增殖的情況[3]。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測了60例DLBCL標(biāo)本中Ki-67的表達情況，分析Ki-67與DLBCL的分型、IPI指數(shù)、療效及預(yù)后之間的關(guān)系，以期為臨床工作提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取南通市腫瘤醫(yī)院2008年3月—2011年2月病理活檢或手術(shù)切除的DLBCL標(biāo)本60例，設(shè)為觀察組。所有患者均為初次發(fā)病，未接受過放化療，未發(fā)現(xiàn)其他腫瘤或免疫缺陷病?；颊叩牟±碗S訪資料均完整。其中，男45例，女15例，年齡15～85歲，平均(56±1.2)歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)淋巴瘤評價標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)及疾病進展(PD)，其中CR+PR組52例，SD+PD組8例；按照DLBCL的免疫表型分型及組織學(xué)參照2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于淋巴造血組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，分為生發(fā)中心B細(xì)胞型(GCB)組14例，非生發(fā)中心B細(xì)胞型(non-GCB)組46例；根據(jù)IPI指數(shù)的高低將患者分為IPI<2組34例和IPI≥2組26例；根據(jù)Ki-67在觀察組中表達的均值，分為Ki-67>均值組35例和Ki-67<均值組25例。另選取淋巴結(jié)反應(yīng)性增生(RH)標(biāo)本20例為對照組，其中男11例，女9例，年齡13～82歲，平均(55±2.2)歲。2組在性別、年齡等一般資料無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 試劑：鼠抗人Ki-67單克隆抗體試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 檢測方法：采用Max Vision免疫組織化學(xué)法，實驗的步驟，嚴(yán)格按照說明書進行。選擇2～3 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟和水化后，煮沸，修復(fù)抗原。室溫下，用過氧化物酶封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，滴加一抗，置于4 ℃冰箱內(nèi)，過夜。PBS二次沖洗后，滴加二抗，室溫下培養(yǎng)30 min。采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，并使用1%鹽酸酒精分化，返藍。脫水、透明、中性樹膠封固。Ki-67表達的陽性對照為已知的乳腺癌切片。

1.3 Ki-67陽性判定標(biāo)準(zhǔn)

Ki-67的陽性著色部位主要位于細(xì)胞核內(nèi)。采用半定量法判斷免疫組織化學(xué)結(jié)果，其陽性標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)清晰地、顆粒狀的棕黃色或黃褐色著色。陽性染色細(xì)胞≥75%為強陽性表達，≥50%為高表達，<50%為低表達。

1.4 觀察指標(biāo)

應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測2組Ki-67表達情況，比較Ki-67在GCB型和non-GCB型中的表達差異，并分析Ki-67與DLBCL分型、IPI、近期療效、預(yù)后的關(guān)系。其中，IPI與預(yù)后相關(guān)的因素包括年齡、血清乳酸脫氫酶(LDH)、行為狀況評分(PS)、Ann Arbor分期及淋巴結(jié)結(jié)外受侵?jǐn)?shù)目。

2 結(jié) 果

2.1 2組Ki-67表達情況

Ki-67定位于細(xì)胞核，能很好地顯示細(xì)胞增殖活性及核分裂現(xiàn)象，其陽性染色的主要表現(xiàn)為明顯的黃褐色或棕黃色顆粒，呈灶性、散在性或彌漫性分布[3]。在觀察組和對照組中，Ki-67的平均陽性表達率分別為(69.17±14.73)%和(40.50±14.95)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.509，P<0.0001)。且Ki-67在對照組中的表達部位大多在生發(fā)中心。

2.2 觀察組各亞組間Ki-67表達比較

GCB型組和non-GCB型組、IPI<2組和IPI≥2組以及CR+PR組和SD+PD組中Ki-67的平均表達率經(jīng)t檢驗，均有顯著差異。見表1。

2.3 Cox模型多因素分析

觀察組患者IPI指數(shù)的各項指標(biāo)應(yīng)用Cox模型進行多因素分析，結(jié)果顯示: IPI指數(shù)中的各項指標(biāo)均與患者預(yù)后有著密切的關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4 觀察組Ki-67表達與預(yù)后的關(guān)系

Ki-67在觀察組陽性表達的均值為69.17%，Kaplan-meier法及l(fā)og rank檢驗結(jié)果顯示，Ki-67>均值組和Ki-67<均值組的3年生存率分別為40.62%和82.14%，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 觀察組各亞組間Ki-67的表達比較

表2 Cox模型多因素分析表

3 討 論

DLBCL是一種異質(zhì)性極強的疾病,其發(fā)病機制復(fù)雜，其中包括了染色體易位、異常體細(xì)胞高頻率突變、基因擴增、缺失和突變等方面。目前臨床上應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測Bcl-6、CD10、MUM1的表達情況，將DLBCL分為GCB型和non-GCB型，有研究[4-6]表明GCB型的預(yù)后明顯較non-GCB好。Ki-67是G1、S、G2、M期細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，G0期則缺乏該蛋白，所以Ki-67的表達可作為判斷腫瘤細(xì)胞增生活性的指標(biāo)[7-8]。近年來，一些學(xué)者通過檢測Ki-67來反映DLBCL的增殖活性，并研究其與DCBCL的生物學(xué)行為、療效、預(yù)后的關(guān)系。

本研究比較了Ki-67在淋巴瘤組織及淋巴結(jié)反應(yīng)性增生中的表達差異，結(jié)果顯示觀察組表達高于對照組，且Ki-67在細(xì)胞分裂的不同時相表達水平有所不同，在M期時Ki-67表達水平最高，因此Ki-67是腫瘤細(xì)胞高增殖活性的標(biāo)志[9]，提示Ki-67的表達對兩者的鑒別診斷具有一定的參考價值。

Ki-67的增殖指數(shù)的高低與很多腫瘤的浸潤、分化程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，因此，Ki-67被廣泛作為惡性腫瘤增殖狀態(tài)的標(biāo)記物之一[10-12]。本研究結(jié)果顯示，DLBCL免疫類型與Ki-67的表達水平有關(guān)。在惡性程度相對較低的GCB型組中，Ki-67的表達水平較低，而在惡性程度相對較高的non-GCB型組中，Ki-67表達水平較高，且Ki-67在2組中的表達是有顯著差異的(P<0.05)，提示DLBCL免疫類型與Ki-67的表達水平有相關(guān)性。

IPI包含年齡、血清乳酸脫氫酶、行為狀況評分、Ann Arbor分期、淋巴結(jié)結(jié)外受侵?jǐn)?shù)目[13]。在本研究中，對60例DLBCL患者的IPI指數(shù)各項指標(biāo)應(yīng)用Cox模型進行多因素分析，結(jié)果提示IPI指數(shù)的各項指標(biāo)均與患者預(yù)后有著密切的關(guān)系，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Ki-67在IPI<2組和IPI≥2組中的表達具有顯著差異，可以推測Ki-67的高表達預(yù)示著惡性腫瘤細(xì)胞增殖更快，更易出現(xiàn)浸潤其他淋巴結(jié)及結(jié)外器官，導(dǎo)致患者有更加不良的預(yù)后。因此，Ki-67可作為評判患者預(yù)后的一項重要指標(biāo)，是對IPI指數(shù)的重要補充，兩者聯(lián)合檢測對預(yù)測患者的病情發(fā)展有重要意義。

本研究還證實了近期療效與Ki-67表達水平相關(guān)，在CR+PR組中Ki-67表達水平高，在SD+PD組中表達水平較低。Ki-67的高表達，顯示了腫瘤細(xì)胞的高增殖性，也顯示了腫瘤的高侵襲性，高侵襲性的腫瘤往往對化療的敏感性較高，近期療效較好。多數(shù)研究[14-15]表明，Ki-67的表達水平與患者的預(yù)后相關(guān)，Ki-67表達水平越高，腫瘤細(xì)胞增殖越快，則患者的預(yù)后越差。本研究根據(jù)Ki-67表達的均值分為Ki-67>均值組和Ki-67<均值組，對2組的生存進行分析，結(jié)果顯示Ki-67<均值組的3年生存率顯著長于Ki-67>均值組，原因可能是Ki-67高表達患者對化療藥物相對比較敏感，近期療效較好，但這類患者容易復(fù)發(fā)和浸潤。

DLBCL無公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物來反映其預(yù)后

情況，但本研究結(jié)果表明Ki-67能夠在一定程度上預(yù)測疾病的預(yù)后情況，可以用來作為DLBCL不良生物學(xué)行為、對化療相對敏感性及預(yù)后不良的指標(biāo)。

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