盛清凱，姜殿文，劉艷艷，竇紅艷，宣玉娟，武 英

(1.山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點試驗室，山東 濟南250100；2.山東省樂陵市畜牧獸醫(yī)局，山東 樂陵 253600；3.山東省農(nóng)科院生物技術研究中心，山東 濟南250100)

日糧中納豆芽孢桿菌對體外豬糞發(fā)酵液中臭氣及微生物的影響

盛清凱1，姜殿文2，劉艷艷3，竇紅艷1，宣玉娟1，武 英1

(1.山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點試驗室，山東 濟南250100；2.山東省樂陵市畜牧獸醫(yī)局，山東 樂陵 253600；3.山東省農(nóng)科院生物技術研究中心，山東 濟南250100)

為了減少舍外糞便污染，研究日糧中納豆芽孢桿菌對體外豬糞發(fā)酵液中氨氣、硫化氫、糞臭素及菌群的影響。試驗組生豬飼喂納豆芽孢桿菌日糧，對照組無納豆芽孢桿菌。結果表明，試驗組氨氣、硫化氫、色氨酸、吲哚-3-乙酸、糞臭素濃度極顯著低于對照組(P<0.01)，吲哚顯著低于對照組(P<0.05)。對照組豬糞發(fā)酵液優(yōu)勢菌以芽孢桿菌(CWBI B1434)為主，含量為26%；試驗組以非解乳糖鏈球菌(AF201899)為主，含量為36%，其次為噬淀粉乳酸桿菌，含量為16%。結果表明納豆芽孢桿菌通過調(diào)整豬糞菌群降低臭味物質(zhì)濃度。為了減少舍外糞便污染，建議豬日糧中添加納豆芽孢桿菌。

豬糞；納豆芽孢桿菌；氨氣；硫化氫；糞臭素

豬糞尿污染已成為嚴重的社會公害，引起了人們的廣泛關注。目前已發(fā)現(xiàn)豬糞尿中惡臭物質(zhì)160多種，主要為氨氣、硫化氫以及糞臭素等[1-2]。豬糞尿臭味物質(zhì)來源于動物的糞尿。為了減少糞尿污染，人們常在日糧中添加乳酸菌等外源微生物及配制氨基酸平衡日糧等[3]。由于糞尿主要在舍外堆積過程中產(chǎn)生臭味物質(zhì)，污染環(huán)境。受動物體內(nèi)外環(huán)境的影響，調(diào)整日糧對舍外糞便臭味物質(zhì)的產(chǎn)生常常無影響。

納豆芽抱桿菌(BacillusNatto)對高溫、酸性、膽鹽和人工胃液有一定的耐受能力[4]。日糧中納豆芽孢桿菌可以降低糞尿中氨氣的濃度[5]，但對舍外糞便中硫化氫、糞臭素及菌群的影響尚不清楚。納豆芽孢桿菌既可以添加到日糧中又可以在發(fā)酵床墊料中消納糞污[6]。本試驗旨在研究日糧中的納豆芽孢桿菌對體外豬糞氨氣、硫化氫、糞臭素及微生物的影響，為舍外糞便污染減排提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

80頭體重為(50.0±0.5)kg的杜長大三元雜交商品豬。

1.2 試驗設計

將80頭豬隨機分為對照組和試驗組，每組4個重復，每重復10頭豬。兩組分別飼喂基礎日糧及添加0.2%納豆芽孢桿菌的試驗日糧，均水泥地面飼養(yǎng)。納豆芽孢桿菌含量為109CFU/g(山東華牧天元農(nóng)牧股份公司提供)。6周后，對照組和試驗組每組每個重復中隨機選取1頭豬，將該16頭豬每頭豬的新鮮糞便280 g懸浮在無菌厭氧的礦物質(zhì)介質(zhì)中(每升含NaHCO35.0 g，NaCl 0.9 g，(NH4)2SO40.9 g ，KH2PO40.45 g，K2HPO4.3H2O 0.45 g，CaC12.2H2O 0.03 g，MgCl20.02 g，MnSO4.4H2O 0.01 g，CoCl2.6H2O 0.01 g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01 g，半胱氨酸濃度為10% 溶液1.0 mL)。將這種懸浮液隨即轉(zhuǎn)移到無菌充滿CO2的塑料袋中，拍打5 min，后用6層滅菌紗布過濾以除去粗微粒物質(zhì)。將10%(W/V) 糞水厭氧分別分裝于150 mL無菌瓶中，每瓶3個重復，每瓶100 mL。38 ℃厭氧下分別培養(yǎng)24 h，然后從各瓶中各取出20 mL溶液，進行氨氣、硫化氫、糞臭素及糞臭素相關指標的測定。將對照組和試驗組的豬糞發(fā)酵液各自混勻，液氮冷凍保存，進行菌群分析。

1.3 臭味物質(zhì)的測定

氨采用納氏比色法測定；硫化氫采用碘量法測定；色氨酸、吲哚、吲哚-3-乙酸、糞臭素采用HPLC法[7]進行測定。

1.4 豬糞發(fā)酵液中菌群分析

提取DNA利用通用引物V3-340F、V3-532R擴增細菌16S rDNA V3區(qū)，利用熒光標記單鏈構象多態(tài)性及片段長度多態(tài)性(F-SSCP-FLP)技術進行PCR擴增，然后3730xl全自動分析儀進行毛細管電泳分離[8]，NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，確定發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群的種類、含量及同源性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS(V9.1) 軟件GLM(general linear models) 程序?qū)λ袛?shù)據(jù)進行處理,對照組和試驗組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.01 為差異極顯著,P<0.05 為差異顯著。數(shù)據(jù)結果用平均數(shù)±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌對豬糞臭味物質(zhì)的影響

試驗組中氨氣、硫化氫、色氨酸、吲哚-3-乙酸及糞臭素濃度極顯著低于對照組(P<0.01)，吲哚濃度顯著低于對照組(P<0.05)，表明試驗日糧中的納豆芽孢桿菌可以減少豬糞發(fā)酵液中氨氣、硫化氫及糞臭素的濃度(表1)。

2.2 發(fā)酵液優(yōu)勢菌群

對照組中優(yōu)勢菌為芽孢桿菌(CWBIB1434)，含量為26%。試驗組中優(yōu)勢菌為非解乳糖鏈球菌(AF201899)，含量為36%；其次為噬淀粉乳桿菌。試驗組中多檢出芽孢桿菌(MA001)、噬淀粉乳酸桿菌。對照組和試驗組優(yōu)勢菌種類及組成不同，表明發(fā)酵液中的菌群受日糧納豆芽孢桿菌影響(表2)。

2.3 豬糞發(fā)酵液微生物同源性分析

圖1和圖2 相比，檢出條帶明顯增多。圖1 中芽孢桿菌CWBI B1434(C31-1-B11)與乳酸菌(C31-1-B1)同源性為31%。賴氨酸芽孢桿菌G10(C3/1-1-B2)與芽孢桿菌(B308-C31-1H7)同源性為100%。圖2中增加了圖1中未能培養(yǎng)的鏈球菌(T33147 V3R.)及未能培養(yǎng)的梭菌(T331E11V3R)。

表1 不同臭味物質(zhì)的變化Table 1 Change of different odours in pig fermentation broths mg/L

注：同列肩注小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；肩注大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

Notes: Values with different lowercase superscripts mean significant difference(P<0.05),different uppercase superscripts mean extreme difference(P<0.01).

表2 發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌群Table 2 Dominant bacteria in fermentation broths

3 討 論

養(yǎng)豬過程中產(chǎn)生的氨氣、硫化氫、糞臭素等惡臭物質(zhì)不僅嚴重影響了豬的生長發(fā)育，也使豬場附近居民受到危害?？諝庵械陌睔馕廴臼撬嵊晷纬傻闹匾蛑?，而畜禽生產(chǎn)已經(jīng)成為全球最大的氨氣污染來源。益生菌作為一種無毒、無殘留、無抗藥性的飼料添加劑，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、降低排泄物氨氣散發(fā)量等諸多功能。為了改善養(yǎng)殖環(huán)境，日糧中常添加益生菌。納豆芽孢桿菌作為一種益生菌，可添加于豬日糧中[9]，也可作為一種發(fā)酵床菌種使用[6]，減少氨的產(chǎn)生。本文中納豆芽孢桿菌降低了豬糞發(fā)酵液氨氣濃度，與楊鋒[5]試驗結果相似。氨的降低可能與納豆芽孢桿菌分泌蛋白酶[10]及噬淀粉乳桿菌等菌群[11]改變相關。蛋白酶降解蛋白質(zhì)，有利于氨的轉(zhuǎn)化。噬淀粉乳桿菌在腸道分泌淀粉酶[12]、植酸酶[13]，也有利于氨的轉(zhuǎn)化[14]。

圖1 對照組豬糞發(fā)酵液微生物相似性分析Fig.1 Microbial similarity in control group pig manure fermentation broths

圖2 試驗組豬糞發(fā)酵液微生物相似性分析Fig.2 Microbial similarity in test group pig manure fermentation broths

本試驗納豆芽孢桿菌降低豬糞發(fā)酵液產(chǎn)硫化氫濃度，結論與Lee等[15-16]相似。納豆芽孢桿菌降低硫化氫含量的機理可能在于芽孢桿菌群(M001)。Yumoto 等報道芽孢桿菌(M001)分泌物具有過氧化氫酶、氧化酶的活性，可以減少硫化氫的產(chǎn)生[17]。

本試驗中試驗組飼料添加芽孢桿菌，降低了豬糞發(fā)酵液中糞臭素的濃度，與色氨酸轉(zhuǎn)化途徑中微生物的改變影響糞臭素的形成[18-19]一致，差異之處可能在于影響的微生物菌不同。本試驗中豬糞發(fā)酵液的優(yōu)勢菌為非解乳糖鏈球菌(AF201899)和噬淀粉乳桿菌。豬腸道中參與色氨酸轉(zhuǎn)化成糞臭素的菌尚不完全清楚。目前報道的豬腸道中參與糞臭素降解的菌為：乳酸菌(11201)[20]、梭菌(drakeiiandskatologenesis[21]、disporicum[22]、ATCC 25775[23])。關于非解乳糖鏈球菌(AF201899)的功能，目前尚未見報道。Rinkinen 等[24]報道非解乳糖鏈球菌為狗空腸和糞便中產(chǎn)乳酸的優(yōu)勢菌，Vandanme等[25]報道非解乳糖鏈球菌分泌物具有β-糖苷酶、α-牛乳糖苷酶、淀粉酶、脲酶的活性，酸性物質(zhì)來源于半乳糖、牛乳糖等物質(zhì)。日糧中的乳酸可降低腸道中糞臭素的含量[26-27]。噬淀粉乳桿菌為一種有益菌[28]，分泌乳酸及淀粉酶[12]，在豬結腸中在半乳低聚糖和雙歧桿菌的作用下促進生長[29]。目前尚未見噬淀粉乳桿菌直接降解糞臭素的報道。糞臭素在體外可被鏈球菌6020[30]及乳酸菌1.12[31]降解。本試驗中非解乳糖鏈球菌(AF201899)、噬淀粉乳酸桿菌及芽孢桿菌(M001)的功能尚需進一步驗證。

4 結 論

日糧中的納豆芽孢桿菌通過影響豬糞發(fā)酵液中的菌群降低豬糞氨氣、硫化氫及糞臭素的濃度。日糧中添加納豆芽孢桿菌，有益于體外豬糞臭氣的減少。

[1]史清河.通過日糧調(diào)控減少豬排泄物中氨與硫化氫的產(chǎn)生與散發(fā)量[J].家畜生態(tài)，2000,22(1):34-39.

[2]Weems J M,Cutler N S,Moore C,et al.3-Methylindole is mutagenic and a possible pulmonary carcinogen[J].Toxicol Sci,2009,112(1):59-67.

[3]Wutzke K D,Lotz M,Zipprich C.The effect of pre- and probiotics on the colonic ammonia metabolism in humans as measured by lactose-[15N2] ureide[J].Eur J Clin Nutr,2010,64(10):1 215-1 221.

[4]董尚智，陳遠鳳，黃燕華，等.納豆芽孢桿菌的飼料學特性研究[J].動物營養(yǎng)學報，2009，21(3):371-378.

[5]楊 鋒.枯草芽孢桿菌的抗逆特性及其對仔豬生化指標和氨氣排放的影響[D].杭州：浙江工商大學,2011.

[6]盛清凱，趙紅波，武 英，等.納豆芽孢桿菌對生豬腸道菌群和肝臟 CYP2A6 的影響[C]// 生態(tài)環(huán)境與畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展學術研討會暨中國畜牧獸醫(yī)學會2012年學術年會會議論文集，2012:111.

[7]夏枚生，胡彩虹，許梓榮.果寡糖對豬糞便細菌群作用下L- 色氨酸代謝的影響[J].中國畜牧雜志，2004,40(1)：11-13.

[8]劉 毅,徐維家,李 妍.人工神經(jīng)原網(wǎng)絡處理PCR數(shù)據(jù)在細菌鑒定中的應用[J].中國微生態(tài)學雜志,2009,21(5):468-473.

[9]耿春銀,張 敏,孫 健,等.納豆菌微生態(tài)制劑替代抗生素用于斷奶仔豬飼料的研究[J].中國飼料,2010(15): 24-27.

[10]張慶寧，胡 明，朱榮生，等.生態(tài)養(yǎng)豬模式中發(fā)酵床優(yōu)勢細菌的微生物學性質(zhì)及其應用研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2009(4): 99-105.

[11]蘇 勇,姚 文,朱偉云.益生菌Lactobacillus amylovorus S1 對仔豬后腸菌群的影響.微生物學報，2006，46(6):961-966.

[12]Eom H J,Moon J S,Seo EY,et al.Heterologous expression and secretion of Lactobacillus amylovorus alpha-amylase in Leuconostoc citreum[J].Biotechnol Lett,2009,31(11): 1 783-1 788.

[13]Sreeramulu G,Srinivasa D S,Nand K,et al.Lactobacillus amylovorus as a phytase producer in submerged culture[J].Letters in Applied Microbiology,1996,23(6):385-388.

[14]李 勇.玉米淀粉結構及膨化和酶制劑影響仔豬日糧消化性研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2010.

[15]Lee S J,Shin N H,Ok J U,et al.Effects of dietary synbiotics from anaerobic microflora on growth performance,noxious gas emission and fecal pathogenic bacteria population in weaning pigs[J].Asian-Aust J Anim Sci,2009,22(8):1 202-1 208.

[16]李曉剛.巨大芽孢桿菌降低蛋雞排泄物中氨和硫化氫機理的研究[D].揚州：揚州大學，2012.

[17]Yumoto I,Hirota K,Yamaga S,et al.Bacillus asahii sp nov,a novel bacterium isolated from soil with the ability to deodorize the bad smell generated from short-chain fatty acids[J].Int J Syst Evol Microbiol,2004,54(6):1997-2001.

[18]Vhile S G,Kjos N P,Sφrum H,et al.Feeding Jerusalem artichoke reduced skatole level and changed intestinal microbiota in the gut of entire male pigs [J].Animal,2012,6:807-814.

[19]Cai-Yan Li,Chao Wu,Jian-Xin Liu,et al.Spatial variation of intestinal skatole production and microbial community in Jinhua and Landrace pigs [J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2009,89(4):639-644.

[20]Yokoyama M T，Johnson K A，Carlson J R.Factors influencing the production of p-cresol and skatole by Lactobacillus isolated from the rumen and pig feces[C].Chicag,IL,USA：In Proceedings of XVII Conference on Rumen Function,1983,17:19-20.

[21]Whithehead T R，Price N P，Drake H L，et al.Catabolic pathway for the production of skatole and indoleacetic acid by the acetogen clostridium drakei,clostridium scatologenes,and swine manure [J].Appl Environ Microbiol,2008,74:1 950-1 953.

[22]Li C Y,Liu J X,Wang Y Z,et al.Influence of differing carbohydrate sources on l-Tryptophan metabolism by porcine fecal microbiota studied in vitro [J].Livest Sci，2009,120: 43-50.

[23]Doerner K C,Cook K L,Mason B P.3-Methylindole production is regulated in clostridium scatologenes ATCC 25775[J].Lett Appl Microbiol,2009,48: 125-132.

[24]Rinkinen M L,Koort J M,Ouwehand A C,et al.Streptococcus alactolyticus is the dominating culturable lactic acid bacterium species in canine jejunum and feces of four fistulated dogs[J].FEMS Microbiology Letters,2004,230(1):35-39.

[25]Vandamme P,Devriese L A,Haesebrouck F,et al.Streptococcus intestinalis Robinson.et al,1988 and Streptococcus alactolyticus Farrow.et al,1984 are phenotypically indistinguishable[J].Int J Syst Bacteriol,1999,49(2): 737-741.

[26]?verlanda M,Kjosb N P,Borgc M,et al.Organic acids in diets for entire male pigs: Effect on skatole level,microbiota in digesta,and growth performance[J].Livestock Science,2008,115(2-3):169-178.

[27]Nowak A,Libudzisz Z.Ability of probiotic Lactobacillus casei DN 114001 to bind or/and metabolise heterocyclic aromatic amines in vitro[J].Eur J Nutr，2009,48(7):419-427.

[28]Kim P I,Jung M Y,Chang Y H,et al.Probiotic properties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from porcine gastrointestinal tract[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,74(5):1 103-1 111.

[29]Martinez R C,Cardarelli H R,Borst W,et al.Effect of galactooligosaccharides and Bifidobacterium animalis Bb-12 on growth of Lactobacillus amylovorus DSM 16698,microbial community structure,and metabolite production in an in vitro colonic model set up with human or pig microbiota[J].FEMS Microbiol Ecol,2013,84(1) : 110-123.

[30]李 鳳.公豬膻味物質(zhì)糞臭素的乳酸菌降解研究[D].重慶: 西南大學,2011: 141-142.

[31]Xiao Meng,Zhi Fei He,Hong Jun Li.Purification and characterization of a novel skatole-degrading protease from lactobacillus brevis 1.12[J].Food Sci Biotechnol，2013,22(5):1 367-1 373.

EffectofBacillusNattoinDietonOdorsandMicrobesinPigManureFermentationBrothsinVitro

SHENG Qing-kai1,JIANG Dian-wen2,LIU Yan-yan3,DOU Hong-yan1,XUAN Yu-juan1,WU Ying1

(1.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicineofSAAS/ShandongProvincialKeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan，Shandong250100,China；2.LaolingCityBureauofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,Laoling,Shandong253600,China;3.BiotechnologyResearchCenter,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan，Shandong250100,China)

In order to reduce the pollution of pig manure outdoors,the study investigated the effect ofBacillusnattoin diet on ammonia,hydrogen sulfide,skatole and microbes in pig manure fermentation broths.The test group pigs intook diet with additionalBacillusnattoAnd the liquid manures were anaerobic fermented.When compared to the control group,contents of ammonia,hydrogen sulfide,Tryp,indole -3- acetic acid and skatole in test group lowered(P<0.01) and indole decreased(P<0.05).The Bacillus sp(CWBI B1434) was the predominate bacteria in control group with a content of 26%,the lactose Streptococcus(AF201899) predominated in the test group with a content of 36% andLactobacillusamylovorus16% secondly.The results showed thatBacillusnatto reduced odor contents by influencing the pig manure microbes.Supplementation ofBacillusnattoin diet was beneficial to reduce the pollution of pig manure outdoors.

pig manure；Bacillusnatto；ammonia；hydrogen sulfide；skatole

2014-04-16，

2014-06-17

國家自然基金(31172245)

盛清凱(1971-)，男，山東陵縣人，博士，研究員，研究方向為單胃動物營養(yǎng)與環(huán)境科學。E-mail：qksheng@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)10-0036-05