胸腺素β10在人肺腺癌細(xì)胞株A549中抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖機(jī)制研究

李紫璇 曲連悅 鐘紅珊 徐克 邱雪杉

近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率增長很快，且呈不斷上升趨勢，已經(jīng)成為對人類健康危害最大的腫瘤[1]。由于很多患者確診時(shí)已是癌癥的中晚期，肺癌的5年生存率依然很低[2]，因此需要對肺癌的分子生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行深入的研究。凋亡對促進(jìn)機(jī)體的發(fā)育及去除老化，損傷組織方面有重要作用[3]。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞能在有環(huán)境壓力的條件下逃避凋亡，并且快速增殖。如何能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖是目前亟待解決的科學(xué)問題。

胸腺素β10（thymisin β10, Tβ10）胸腺素家族的成員，在人體中分布廣泛。作為一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，Tβ10在細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)[3-5]報(bào)道Tβ10在炎癥反應(yīng)、腫瘤的增殖、凋亡、血管形成方面發(fā)揮重要的作用。然而Tβ10在不同類型的腫瘤中所發(fā)揮的作用有很大差異。在甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中Tβ10能夠促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[4,6,7]；而在卵巢癌組織和細(xì)胞中Tβ10表達(dá)降低，并起到抑制腫瘤的生長、促進(jìn)腫瘤的凋亡的作用[8]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)Tβ10在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中表達(dá)上調(diào)，并與肺癌的分期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后有關(guān)[9]，Tβ10可能是通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth facor-C ,VEGF-C）的表達(dá)促進(jìn)淋巴管的形成[10]。然而Tβ10對肺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制尚不清楚。

本研究選擇肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為研究對象，通過加入Tβ10或用小干擾RNA干擾Tβ10的方法，檢測肺癌細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞周期的變化，探討Tβ10對肺癌細(xì)胞這幾種生物學(xué)行為的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清購自碧云天。外源Tβ10蛋白（38-43）購自Abcam，小干擾RNA購自上海吉瑪，轉(zhuǎn)染試劑購自Qiagen。RNA提取購自Invitrogen，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒及PCR引物合成購自Takara。抗 P53、Caspase-3、Cyclin A、Cyclin E單克隆抗體購自CST；β-actin抗體購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG購自中杉金橋。BCA法蛋白定量試劑盒購自碧云天，裂解液及超敏發(fā)光試劑盒購自Pierce。CCK-8凋亡檢測試劑盒購自日本同仁，流式凋亡檢測試劑盒購自BD。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549使用含有10%的小牛血清DMEM培養(yǎng)基，37oC、5%CO2的條件下培養(yǎng)，每兩天換一次液，并用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。在加入Tβ10組實(shí)驗(yàn)前取對數(shù)生長的細(xì)胞，饑餓4 h后加入100 ng/mL Tβ10，按時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)染siNC和siTβ10組于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)染序列如下：siNC：sense：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'，anti-sense：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA Aヰ-3'；siTβ10：sense：5'-CGA CCA AAG AGA CCA UUG ATT-3'，anti-sense：5'-UCA AUG GUC UCU UUG GUC Gヰ-3'。每次實(shí)驗(yàn)同一個(gè)處理因素設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)定量 PCR 細(xì)胞提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green法，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，總體積20 μL。擴(kuò)增過程如下： 95 °C，30 s；95 °C，5 s；60 °C，30 s，40個(gè)循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參?；蛳鄬Ρ磉_(dá)水平計(jì)算方式如下：ΔCt=Ctgene-Ctreference，增加倍數(shù)用2-ΔΔCt方法計(jì)算.每次試驗(yàn)均做三個(gè)重復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞加入Tβ10 24 h或轉(zhuǎn)染siTβ10 48 h后，使用PBS清洗兩次，0.25%胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基終止消化后，將細(xì)胞收集到EP管中，1,000 rpm 4 °C離心5 min后，去上清。用PBS洗兩遍后每個(gè)樣本中加400 μL緩沖液，吹打成單細(xì)胞懸液，后避光加入FITC/Annexin V 10 μL和PI 5 μL染色20 min后上機(jī)檢測。

1.5 細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h后的單個(gè)細(xì)胞懸浮在96孔培養(yǎng)板中，密度為5×103個(gè)/100 μL/孔，加入Tβ10組于檢測前24 h加入Tβ10，檢測前4 h每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8?繼續(xù)培養(yǎng)。檢測時(shí)在450 nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 細(xì)胞周期檢測 收集待檢測細(xì)胞用冰PBS清洗兩次，75%乙醇固定30 min，固定好的細(xì)胞使用冰PBS清洗兩次，使用300 μL PI避光染色30 min，流式細(xì)胞儀每個(gè)樣本抽取10,000個(gè)細(xì)胞，處于G0期/G1期、S期和G2期/M期的細(xì)胞分別被計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4 °C，12,000 rpm/min，30 min），提取上清為總蛋白。每個(gè)泳道加入總蛋白60 μg，12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印（60 V，120 min）到PVDF上。5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉2 h?？筆53、Caspase-3、Cyclin A、Cyclin E和β-actin（1：1,000）4 °C孵育過夜。分別與對應(yīng)的二抗（1：2,000）室溫孵育2 h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度測定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tβ10對A549細(xì)胞凋亡的影響 在A549細(xì)胞中加入100 ng/mL Tβ10，在對照組加入同體積的PBS，24 h后使用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示：加PBS組細(xì)胞凋亡率為（5.70±0.27）%，而加入100 ng/mL Tβ10組細(xì)胞凋亡率為（2.87±0.12）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。隨后我們使用了Tβ10的小干擾RNA，在保證了轉(zhuǎn)染效率的前提下（圖1B），檢測兩組的凋亡水平變化。轉(zhuǎn)染siNC組細(xì)胞凋亡率為（4.25±0.24）%，而轉(zhuǎn)染siTβ10組細(xì)胞凋亡率為（13.11±0.49）%，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。以上結(jié)果說明Tβ10可以抑制A549細(xì)胞的凋亡。

2.2 Tβ10對A549細(xì)胞增殖和周期的影響 在A549細(xì)胞中加入100 ng/mL Tβ10，24 h后發(fā)現(xiàn)該組細(xì)胞增殖能力高于加入PBS的對照組。同時(shí)，轉(zhuǎn)染siTβ10組與轉(zhuǎn)染siNC組比，細(xì)胞的增殖能力則減弱，見圖2A。為了探究Tβ10對細(xì)胞增殖的調(diào)控是否和細(xì)胞周期的改變有關(guān)，我們使用流式單染觀察各組細(xì)胞周期的變化。分析發(fā)現(xiàn)，加入Tβ10組G2期/M期，和S期的細(xì)胞比率增加，G0期/G1期的細(xì)胞數(shù)減少；與轉(zhuǎn)染siNC組相比，轉(zhuǎn)染siTβ10后G2期/M期和S期的細(xì)胞比率顯著減少，G0期/G1期的細(xì)胞數(shù)增加（圖2B、圖2C）。以上結(jié)果說明Tβ10可以影響A549細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖1 流式細(xì)胞分選檢測Tβ10對A549細(xì)胞凋亡的影響。A：加入Tβ10能抑制A549細(xì)胞凋亡，干擾Tβ10則能促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡；B：Real-time PCR檢測Tβ10的干擾效率。**P＜0.01。Fig 1 Apoptosis rate of cell was detected after Tβ10 or siTβ10 treatment by FCM assay. A: Add Tβ10 in A549 can inhibit the apoptosis rate,whereas transfection of Tβ10 siRNA can prompt apoptosis； B: Transfection efficiency of Tβ10 siRNA was detected by Real-time PCR. **P＜0.01.FCM: flow cytometry.

2.3 Tβ10對增殖和凋亡相關(guān)基因的影響 使用實(shí)時(shí)定量PCR篩查了一系列影響增殖和凋亡的基因發(fā)現(xiàn)，加入Tβ10能顯著促進(jìn)Cyclin A、Cyclin E的表達(dá)，抑制P53、Caspase-3的表達(dá)。反之，干擾Tβ10則能抑制Cyclin A、Cyclin E表達(dá)，促進(jìn)P53、Caspase-3的升高，其他基因的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A）。隨后我們用蛋白免疫印跡的方法驗(yàn)證了變化明顯的幾個(gè)基因的蛋白水平，加入Tβ10能顯著促進(jìn)Cyclin A、Cyclin E蛋白的表達(dá)，抑制P53、Caspase-3的表達(dá)；干擾Tβ10抑制Cyclin A、Cyclin E表達(dá)，促進(jìn)P53、Caspase-3表達(dá)（圖3B）。這些結(jié)果提示Tβ10抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖可能是通過抑制P53、Caspase-3，促進(jìn)Cyclin A、Cyclin E表達(dá)的方式實(shí)現(xiàn)的。

3 討論

目前，關(guān)于Tβ10在腫瘤中作用的研究主要集中在它對侵襲、轉(zhuǎn)移的影響上。多篇文獻(xiàn)[5,11-13]報(bào)道，Tβ10能在甲狀腺乳頭狀癌、肝癌、膽管癌等腫瘤中促進(jìn)腫瘤的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移 。Tβ10與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系的報(bào)道較少，最新的研究[14]發(fā)現(xiàn)Tβ10可以通過上調(diào)ROS的水平促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。

在本研究中我們探討了Tβ10對肺癌細(xì)胞凋亡的作用。根據(jù)文獻(xiàn)[6,15]報(bào)道，我們采用加入外源Tβ10的方法。發(fā)現(xiàn)加入Tβ10可以抑制肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的凋亡并使在凋亡過程中起關(guān)鍵作用的酶Caspase-3的水平降低，而使用小干擾RNA干擾Tβ10則能促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡并伴有Casepase-3的升高，這些結(jié)果提示Tβ10在肺癌中能起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。腫瘤細(xì)胞能夠抑制凋亡的機(jī)制有多種，P53蛋白表達(dá)的下調(diào)是其中重要原因。作為腫瘤抑制基因，P53的突變在腫瘤中是一個(gè)普遍的現(xiàn)象[16]，P53突變下調(diào)后能抑制DNA修復(fù)基因的激活導(dǎo)致腫瘤凋亡水平的降低[17]。在本研究中加入Tβ10抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)P53的作用可能是通過抑制P53的功能實(shí)現(xiàn)的。本研究Tβ10在肺癌細(xì)胞中能夠抑制凋亡的結(jié)果和前人關(guān)于Tβ10在卵巢癌細(xì)胞凋亡中的作用正好相反，Tβ10在不同腫瘤細(xì)胞系中影響的凋亡相關(guān)通路也不盡相同。這些說明了在不同的細(xì)胞系中Tβ10所起的作用存在很大差異，需要進(jìn)一步的研究來完善對Tβ10功能的準(zhǔn)確認(rèn)識。

本研究還發(fā)現(xiàn)Tβ10能影響肺癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期。加入Tβ10能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，同時(shí)增加G2期/M期和S期的細(xì)胞比率；反之，干擾Tβ10能降低細(xì)胞的增殖能力并增加處于G0期/G1期的細(xì)胞比率。細(xì)胞周期的變化和細(xì)胞周期素的含量有直接關(guān)系，通過檢測發(fā)現(xiàn)，加入Tβ10能增加Cyclin A、Cyclin E mRNA及蛋白的表達(dá)水平，干擾Tβ10則能降低Cyclin A、Cyclin E mRNA及蛋白的表達(dá)水平。Cyclin A主要起到促進(jìn)S期向G2期/M期轉(zhuǎn)化，并在細(xì)胞增殖過程中起重要作用，而Cyclin E則為細(xì)胞從G0期/G1期進(jìn)入S期的限速因子，且兩者均為潛在的腫瘤標(biāo)記物[18]。本研究的結(jié)果揭示了Tβ10對肺癌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用，并提示Tβ10可能通過促進(jìn)Cyclin A、Cyclin E的表達(dá)影響細(xì)胞周期，進(jìn)而發(fā)揮它的促增殖作用。

圖2 CCK-8分析及細(xì)胞周期分析檢測Tβ10對A549細(xì)胞增殖及周期的影響。A：加入Tβ10 能促進(jìn)A549細(xì)胞增殖，干擾Tβ10則能抑制A549細(xì)胞增殖；B、C：加入Tβ10及Tβ10 siRNA 后細(xì)胞周期發(fā)生了顯著的變化。Fig 2 The proliferation and cell cycle of cell was detected after Tβ10 or siTβ10 treatment by cell was detected after Tβ10 and siTβ10 treatment by CCK-8 assay and FCM assay. A: Add Tβ10 in A549 can prompt cell proliferation, whereas transfection of Tβ10 siRNA can inhibit cell proliferation； B,C: The cell cycle changed significently after Tβ10 or siTβ10 treatment.

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白免疫印跡檢測Tβ10對周期、凋亡相關(guān)基因的影響。A: 加入Tβ10或干擾Tβ10后Cyclin A、Cyclin E、P53和Caspase-3 mRNA表達(dá)變化；B: 加入Tβ10或干擾Tβ10后Cyclin A、Cyclin E、P53和Caspase-3蛋白變化情況。**P＜0.01。Fig 3 The mRNA and protein level of Cyclin A, Cyclin E, Caspase-3 and P53 were detected by Real-time PCR and Western blot. A: The change of Cyclin A, Cyclin E, P53 and Caspase-3 mRNA level after add Tβ10 or transfection of Tβ10 siRNA in A549； B: The change of Cyclin A, Cyclin E, P53 and Caspase-3 protein level after add Tβ10 or transfection of Tβ10 siRNA in A549. **P＜0.01.

綜上所述，Tβ10具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞周期的功能。在肺癌細(xì)胞系中Tβ10能夠通過抑制P53的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，能夠通過上調(diào)Cyclin A、Cyclin E的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。抑制Tβ10能起到抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Tβ10可能成為肺癌診斷的分子標(biāo)記物及治療靶標(biāo)。