劉仁旺 劉京豪 李昕 李穎 趙青春 李作生 劉紅雨 陳軍

肺癌已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)腫瘤患者致死的最主要病因之一，其發(fā)病率和死亡率仍然居高不下[1]。傳統(tǒng)的治療方式包括外科手術(shù)治療，化療及放療等，在取得一定療效的同時(shí)，由于較大的副作用而降低了患者的生活質(zhì)量。近年來，通過對(duì)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）等相關(guān)信號(hào)通路的研究及對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）療效及安全性的探索，證實(shí)了EGFR-TKIs在EGFR突變的肺癌患者中取得確切的療效，同時(shí)副反應(yīng)輕，從而改善了患者的生活質(zhì)量[2,3]。因此，靶向治療因其給藥方式簡便、高特異性、耐受性好、無嚴(yán)重副作用等原因，已成為肺癌的重要治療手段之一。

EGFR是上皮源性惡性腫瘤的最重要的一個(gè)分子之一，其活性與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。在肺癌中，EGFR-TKIs治療的優(yōu)勢人群為亞裔、女性、非吸煙的患者，因?yàn)槠涠嗑哂蠩GFR外顯子的突變。EGFR的主要突變位點(diǎn)包括18-21外顯子，其中以19外顯子的缺失突變和21外顯子的點(diǎn)突變最為常見[5]。然而最近研究表明，在各中心試驗(yàn)中EGFR-TKIs應(yīng)用于不同EGFR突變類型患者的效果不盡相同。Lee等[6]通過對(duì)比170例EGFR突變陽性非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者一線應(yīng)用TKIs療效及預(yù)后發(fā)現(xiàn)，不同亞型的EGFR突變患者應(yīng)用EGFR-TKIs療效不同。其中，E746起始的19外顯子缺失突變患者應(yīng)用TKIs藥物后相對(duì)L747起始的缺失突變患者無進(jìn)展生存期（progression free survival, PFS）更長；同時(shí)，21外顯子L858R突變患者PFS比L861R/L861Q更長。李儉杰等[7]亦有報(bào)道，通過比較19外顯子缺失突變及21外顯子點(diǎn)突變晚期NSCLC患者一線應(yīng)用TKIs類藥物療效，發(fā)現(xiàn)外顯子19缺失患者獲益更明顯，表現(xiàn)出有較好的PFS和總生存期（overall survival,OS）。

不同亞型的EGFR突變患者應(yīng)用TKIs藥物時(shí)療效不同的原因尚有爭議，可能與TKIs藥物在不同亞型突變患者中動(dòng)力學(xué)差異相關(guān)[8]，也可能與腫瘤自身特性相關(guān)。因此，本研究以天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科收治的113例EGFR陽性患者為研究對(duì)象，對(duì)比EGFR 19外顯子缺失突變和21外顯子點(diǎn)突變患者的臨床特點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行預(yù)后分析，目的是為了明確EGFR不同突變亞型的臨床特點(diǎn)及預(yù)后差異，旨在為后期對(duì)TKIs藥物應(yīng)用于EGFR不同突變亞型的療效差異原因的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2007年7月1日-2012年7月1日天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科收治的EGFR外顯子19或21突變陽性肺癌患者共113例。其中，男性43例，女性70例；年齡33歲-78歲，中位年齡為61歲；吸煙患者31例，非吸煙82例；左側(cè)原發(fā)49例，右側(cè)原發(fā)64例；按世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）肺癌組織分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織分型，其中鱗癌6例，腺癌95例，腺鱗癌7例，大細(xì)胞肺癌4例，肉瘤樣癌1例；高分化57例，中分化37例，低分化12例，另有7例患者為活檢確診，未能確定分化程度；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）1997年新的修訂標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor node metastasis, TNM）分期，I期31例，II期15例，III期42例，IV期25例。

所有患者均通過手術(shù)病理或穿刺活檢病理確診，其中47例患者采用Real-time PCR或測序分析肺癌患者石蠟組織中EGFR外顯子19、21突變狀況，余66例患者則是采用x-TAG液相芯片技術(shù)進(jìn)行分析。I期-III期患者均行肺癌根治術(shù)，術(shù)后給予4周期輔助化療，其中鱗癌選用吉西他濱聯(lián)合順鉑方案，腺癌選用培美曲塞聯(lián)合順鉑治療。對(duì)于IV期患者，僅胸膜轉(zhuǎn)移者行開胸活檢，種植結(jié)節(jié)灼燒術(shù)，胸膜固定術(shù)后給予化療，方案同上；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者共7例，行穿刺活檢明確病理后，給予化療，方案同上。所有標(biāo)本均以10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋封存。生存時(shí)間從手術(shù)后或穿刺后第1天算起，截止至2014年7月25日。

1.2 Real-time PCR或sequence檢測EGFR突變 采用Real-time PCR 或sequence分析各樣本中EGFR基因突變狀況（包括delE746-A750、delL747-P753insS、L858R及L861Q），詳見本中心已發(fā)表的文獻(xiàn)[9,10]。此兩種方法共檢測出EGFR突變47例。

1.3 xTAG液相芯片技術(shù)檢測EGFR突變 采用xTAG-液相芯片技術(shù)檢測，由廣州益善公司完成。具體方法如下：①從樣本中抽提DNA。②多重PCR擴(kuò)增：將抽提出的DNA（包括突變型和野生型DNA）在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增。③消化處理：通過酶處理第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物，去除多余的引物及游離的核苷酸，防止多余的引物及核苷酸與后續(xù)的探針非特異結(jié)合。④等位基因特異性延伸（allele-specific primer extension, ASPE）：為分辨不同的突變位點(diǎn)，每個(gè)目的基因序列都設(shè)計(jì)有相應(yīng)的ASPE引物，引物的一端與目的基因序列特異性的結(jié)合，在此過程中，系統(tǒng)中摻入有生物素標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP），如果目的基因序列與探針序列相匹配，則可以繼續(xù)延伸，并使反應(yīng)終產(chǎn)物上連有多個(gè)生物素，若兩者不匹配則延伸終止，反應(yīng)終產(chǎn)物上沒有生物素結(jié)合；在引物另一端連接著Tag標(biāo)簽序列，這些序列將與微球上特異的Anti-tag序列相結(jié)。⑤雜交反應(yīng)：將擴(kuò)增產(chǎn)物與交聯(lián)了特異探針的微球進(jìn)行雜交反應(yīng)。⑥Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)：將雜交后的產(chǎn)物放入Luminex儀器進(jìn)行讀數(shù)，根據(jù)微球自身發(fā)出熒光色判別球號(hào)以及對(duì)應(yīng)的檢測基因，根據(jù)微球發(fā)出的熒光強(qiáng)度判別是否有突變。此方法共檢測出EGFR突變66例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用Mann-Whitney檢驗(yàn)對(duì)方差不齊的兩組計(jì)量資料進(jìn)行分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析，應(yīng)用Cox回歸模型分析預(yù)后因素，應(yīng)用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR 19、21外顯子突變患者一般情況的對(duì)比 本研究中，入組患者共113例，其基本特征及臨床特點(diǎn)詳見表1。其中，女性（61.9%）、非吸煙（72.6%）、腺癌（84.1%）多見，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。檢測出EGFR 19外顯子突變患者共56例，21外顯子突變患者共57例。其中19外顯子突變患者平均年齡（57.02±11.31）歲，21外顯子突變患者平均年齡（62.25±7.76）歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者均以女性（19外顯子vs 21外顯子：66.1% vs 57.9%）、非吸煙（19外顯子vs 21外顯子為73.2%vs 71.9%）多見，19、21外顯子突變患者在不同性別和吸煙狀況中的分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者基本特征詳見表2。

表1 入組患者的基本情況Tab 1 Basic information of 113 patients with EGFR mutaion

2.2 EGFR 19、21外顯子突變患者病理生理學(xué)特點(diǎn)分析通過臨床資料收集，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比出19、 21外顯子突變患者腫瘤特點(diǎn)的差異，詳見表3。在腫瘤原發(fā)位點(diǎn)方面，19相對(duì)21外顯子突變患者多好發(fā)于右側(cè)（19外顯子 vs 21外顯子為66.1% vs 47.4%, P=0.045）。兩組患者均以腺癌（外顯子19 vs 外顯子21：80.4% vs 87.7%，P=0.738），高分化腫瘤（19外顯子vs 21外顯子：57.1% vs 43.9%, P=0.621）多見，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，兩組資料TNM分期無明顯差異（I期：19外顯子vs 21外顯子：33.9% vs 21.1%；II期：19外顯子vs 21外顯子：10.7% vs 15.8%；III期：19外顯子vs 21外顯子：35.7% vs 38.6%；IV期：19外顯子vs 21外顯子：19.6% vs 24.6%, P=0.453）。

2.3 EGFR 19、21外顯子突變患者預(yù)后分析 截止到2014年7月25日，在113例EGFR突變患者中，有22例患者失訪，31例患者死亡。將患者分為19外顯子突變組和21外顯子突變組，以患者死亡為事件終點(diǎn)。19外顯子突變組患者失訪12例，中位生存期1,051天，而21外顯子突變組患者失訪10例，中位生存期1,076天，兩者總生存期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.566，圖1）。應(yīng)用Cox回歸分析比較各因素風(fēng)險(xiǎn)比發(fā)現(xiàn)，高、中分化患者風(fēng)險(xiǎn)較低（高分化vs低分化，HR=0.203，95%CI： 0.076-0.543，P=0.001；中分化vs低分化，HR=0.203，95%CI：0.069-0.594，P=0.004），其余各項(xiàng)因素均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步，我們對(duì)患者進(jìn)行分化程度的分層分析，發(fā)現(xiàn)在高中低各分化組患者中，19、21外顯子突變患者未表現(xiàn)出明顯差異，且無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

表2 EGFR 19和21外顯子突變患者臨床特征的比較Tab 2 Different clinical features between exon 19 and 21 mutations

表3 EGFR 19和21外顯子突變患者病理生理特征的比較Tab 3 Comparison of clinical significance between EGFR exon 19 mutation groups and EGFR exon 21 mutation groups

隨后，我們對(duì)兩組患者分別就年齡、性別、吸煙情況對(duì)比分析19外顯子突變患者和21外顯子突變患者的預(yù)后情況。根據(jù)中位年齡，將病例分為≤61歲組和＞61歲組，發(fā)現(xiàn)≤61歲組中19、21外顯子突變患者預(yù)后無明顯差異；在＞61歲組中19外顯子突變患者相對(duì)較好，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A、圖3B）。對(duì)性別進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，在女性患者中，19、21外顯子突變患者預(yù)后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；男性患者中，19外顯子突變患者相對(duì)較好，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C、圖3D）。對(duì)吸煙狀況進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于非吸煙患者，19外顯子突變患者預(yù)后相對(duì)較差，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)于吸煙患者，19外顯子突變患者預(yù)后相對(duì)較好，但差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3E、圖3F）。

進(jìn)一步，我們對(duì)兩組患者分別根據(jù)分期進(jìn)行分層分析。在各期中19、21外顯子突變患者預(yù)后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)于I期和II期患者而言，19外顯子突變患者預(yù)后表現(xiàn)出較差的趨勢；III期患者中兩種突變類型的預(yù)后差異不明顯；IV期患者中19外顯子突變患者預(yù)后有較好趨勢（圖4）。

圖1 EGFR 19和21外顯子突變患者總生存期的對(duì)比Fig 1 The overall survival analysis of the patients with EGFR exon 19 & 21 mutations. EGFR: epidermal growth factor receptor.

圖2 以分化程度分層分析對(duì)比EGFR 19和21外顯子突變患者預(yù)后的差異Fig 2 Comparison of survival curves between EGFR exon 19 mutation groups and exon 21 mutation groups, adjusted to differentiation.

圖3 以年齡、性別、吸煙狀態(tài)進(jìn)行分層分析，對(duì)比EGFR 19和21外顯子突變患者預(yù)后的差異Fig 3 Comparison of survival curves between EGFR exon 19 mutation groups and exon 21 mutation groups, adjusted to age, gender and smoking status.

3 討論

19、21外顯子突變肺癌患者臨床特點(diǎn)的差異尚有爭議。有文獻(xiàn)[11]報(bào)道，EGFR 21外顯子突變肺癌患者中，以女性、腫瘤右側(cè)原發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性及III期、IV期患者多見，但未分析比較兩者預(yù)后差異。國內(nèi)學(xué)者[12]亦有報(bào)道，19外顯子突變肺癌患者相對(duì)21外顯子突變肺癌患者而言女性突變率較高。與上述文獻(xiàn)不同的是，本實(shí)驗(yàn)中剔除了EGFR未突變的患者，沒有比較19及21外顯子突變患者在所有肺癌患者中比例的差異，而是直接對(duì)比兩組患者各參數(shù)的比例的差異，著重于19、21外顯子突變患者在年齡、性別、吸煙狀況、原發(fā)部位、組織類型、分期及分化程度的自然發(fā)生率的對(duì)比。我們中心研究發(fā)現(xiàn)，19外顯子突變患者較21外顯子突變患者年齡較小，且與文獻(xiàn)報(bào)道不同的是19外顯子突變患者右側(cè)原發(fā)較為多見。兩者在性別、吸煙狀況、組織類型、分期及分化程度上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣的方法，Riely等[13]通過對(duì)比美國人口中19、21外顯子突變肺癌患者差異發(fā)現(xiàn)，兩者在性別、種族、吸煙狀況及組織類型的自然發(fā)生率上亦無差異。

我們研究中發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)術(shù)后一線輔助化療的治療方案中，19、21外顯子突變肺癌患者總生存時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)而，我們對(duì)患者進(jìn)行多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)分化程度是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。因此，我們對(duì)患者進(jìn)行分化程度的分層分析，發(fā)現(xiàn)兩組患者并未表現(xiàn)出差異，表明EGFR 19、21外顯子突變肺癌患者在傳統(tǒng)治療模式的基礎(chǔ)上預(yù)后無明顯差異，而由于沒有完整的TKIs治療的臨床資料，故在本組病例中不能分析TKIs的療效，因此，兩組患者對(duì)EGFR-TKIs的療效的差異需要進(jìn)一步探討。

我們進(jìn)一步對(duì)各個(gè)因素分別進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，分別在高齡、男性、吸煙的EGFR突變肺癌患者中，在應(yīng)用傳統(tǒng)術(shù)后一線輔助化療方案時(shí)，19外顯子突變患者均有較好的預(yù)后趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在對(duì)分期進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)早期患者中，19外顯子突變患者預(yù)后表現(xiàn)出較差的趨勢，而IV期患者中19外顯子突變患者預(yù)后有較好趨勢，但仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨訪時(shí)間較短，病例數(shù)較少可能是兩者預(yù)后差異有趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的主要原因。后續(xù)研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量，以明確兩者之間趨勢有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，細(xì)分EGFR 18-21外顯子突變的不同亞型，對(duì)比各亞型的臨床特點(diǎn)、傳統(tǒng)治療預(yù)后差異及TKIs藥物應(yīng)用后預(yù)后差異，旨在為論證不同EGFR突變亞型患者應(yīng)用TKIs藥物效果不同的原因提供理論依據(jù)，同時(shí)指導(dǎo)TKIs藥物對(duì)不同EGFR突變亞型患者的臨床應(yīng)用。

圖4 對(duì)比不同分期的EGFR 19和21外顯子突變患者預(yù)后的差異Fig 4 Comparison of survival curves between EGFR exon 19 mutation groups and exon 21 mutation groups, adjusted to clinical stage.

關(guān)于兩者預(yù)后的對(duì)比的報(bào)道尚不多見，Riely等[13]通過對(duì)比EGFR 19或21外顯子突變共34例肺癌患者在應(yīng)用TKIs藥物的效果，發(fā)現(xiàn)19外顯子突變患者PFS及OS明顯優(yōu)于21外顯子突變患者。亦有文獻(xiàn)[14]報(bào)道，EGFR缺失突變肺癌患者相比其他EGFR突變類型肺癌患者而言對(duì)吉非替尼的反應(yīng)率更高。Zhu等[15]從細(xì)胞水平分析了EGFR19外顯子缺失突變和21外顯子點(diǎn)突變對(duì)吉非替尼反應(yīng)性不同的原因，發(fā)現(xiàn)吉非替尼均能導(dǎo)致EGFR 19外顯子缺失突變和EGFR 21外顯子點(diǎn)突變的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFR、Akt和Erk分子磷酸化受到抑制，但是，對(duì)前者的抑制較后者更明顯。而與21外顯子點(diǎn)突變的細(xì)胞比較，吉非替尼能導(dǎo)致更多的19外顯子缺失的細(xì)胞G1期阻滯。如果從分子水平分析，19外顯子的缺失突變和21外顯子的點(diǎn)突變均發(fā)生于EGFR分子的酪氨酸激酶區(qū)，從空間構(gòu)象上看，19外顯子位于EGFR的αC-helix區(qū)域，而21外顯子位于EGFR分子的A-loop區(qū)[16]。Sordella等[17]報(bào)道，19外顯子突變和21外顯子突變能導(dǎo)致EGFR分子自身磷酸化的位點(diǎn)不一樣，而導(dǎo)致其下游的信號(hào)通路不同，比如，相對(duì)于缺失突變，L858R突變中的845密碼子編碼的酪氨酸殘基表現(xiàn)出高度磷酸化的狀態(tài)。這可能是19外顯子突變肺癌患者相對(duì)21外顯子突變肺癌患者對(duì)TKIs藥物反應(yīng)率較高，應(yīng)用TKIs藥物后預(yù)后較好的原因。

綜上所述，EGFR 19外顯子突變肺癌患者相對(duì)21外顯子突變肺癌患者年齡較小，且右側(cè)原發(fā)較為多見。兩者在性別、吸煙狀況、組織類型、分期及分化程度上無明顯差別。EGFR 19、21外顯子突變肺癌患者總生存時(shí)間無明顯差異，但仍然需要進(jìn)一步研究論證。