高巍松 黃文彥 劉凱珊

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最常見的類型。NSCLC分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞肺癌等，其中肺鱗癌與吸煙有非常密切的關(guān)系。NSCLC是最常見的晚期轉(zhuǎn)移性腫瘤，若不及時治療，中位存活時間為4個月-5個月，1年生存率小于10%[1]。腫瘤發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與細(xì)胞的異常凋亡有關(guān)。在腫瘤形成的過程中，bim基因及其相關(guān)信號通路在細(xì)胞凋亡通路尤其是內(nèi)源性凋亡通路中有重要的作用，以BIM為靶點的NSCLC靶向治療具有不可取代的地位。

1 BH3-only蛋白概述

1.1 細(xì)胞凋亡通路及其與BCL-2家族的關(guān)系 細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括外源性途徑即死亡受體凋亡途徑和內(nèi)源性途徑即線粒體凋亡途徑。內(nèi)源性線粒體凋亡途徑通常是由DNA損傷而激活，通過與促凋亡和抗凋亡BCL-2蛋白家族成員之間的相互作用而調(diào)控[2]。這兩個途徑共同激活半胱天冬酶的級聯(lián)反應(yīng)，并且介導(dǎo)和執(zhí)行凋亡細(xì)胞蛋白水解反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡程序[3]。

Bcl-2基因是目前研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一，存在于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。BCL-2蛋白家族可以分為三類：第一類是抑制細(xì)胞凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、BCL-B（也稱為BCL-2L10）和A1（也稱為BCL-2A1）；而第二類是促細(xì)胞凋亡蛋白，包括BAX、BAK和 BOK（也稱為MTD）；第三類是BH3-only蛋白BAD、BIK（也稱為BLK或NBK）、BID、HRK（也稱為死亡蛋白5，DP5）、BIM（也稱為BCL2L11）、BMF、NOXA和 PUMA（也稱為BBC3）。BH3-only蛋白有一個保守的BH3域，可以結(jié)合并調(diào)節(jié)抗凋亡BCL-2蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。

1.2 BH3-only蛋白和BIM的作用 BH3-only蛋白僅含BCL-2家族4個同源結(jié)構(gòu)域中的BH3區(qū)域，在凋亡的啟動及凋亡通路的溝通中發(fā)揮著極其重要的作用[5]。根據(jù)BH3-only蛋白的不同功能可以分為兩個亞群：“BH3-only凋亡執(zhí)行蛋白”，包括BIM、BID等；“BH3-only凋亡感受蛋白”包括NOXA、BMF等[6]。BH3-only蛋白是通過線粒體凋亡途徑啟動細(xì)胞凋亡程序的[7]。BH3-only蛋白通過抑制BCL-2抗凋亡家族成員，使BAX和BAK釋放，引起線粒體外膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP），活化半胱天冬酶的級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[4]（圖1）。雖然BH3-only蛋白缺乏直接激活BAX和BAK的功能，但是通過與BCL-2家族抗凋亡蛋白結(jié)合，間接激活BAX和BAK[8]。

BIM在BH3-only蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)源性線粒體凋亡途徑中具有核心地位。在人類基因組中，bim基因位于7p15.2，編碼含129個氨基酸的蛋白質(zhì)。Bim基因編碼三個主要的蛋白質(zhì)亞型：BIMS（BIM short）、BIML（BIM long）和BIMEL（BIM extra long）[9]。BIM的所有亞型都含有BH3結(jié)構(gòu)域，結(jié)合并抑制BCL-2家族抗凋亡蛋白成員[10]。不同的BIM異構(gòu)體可通過活化BAX蛋白或抑制BCL-2的活性，抑或兩者都抑制來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡受阻是NSCLC發(fā)生的原因之一。目前NSCLC的治療以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為主。因此，以BIM為靶點的NSCLC治療，在臨床前實驗和臨床應(yīng)用中均具有重要意義。

2 BIM在NSCLC靶向治療中的作用

2.1 表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）誘導(dǎo)BIM表達(dá) EGFR在大多數(shù)NSCLC患者的癌細(xì)胞中都有表達(dá)，并參與細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、血管生成、增加腫瘤轉(zhuǎn)移潛能和藥物抵抗性[1]?？笶GFR特異性的人源化單克隆抗體或小分子TKI能夠抑制EGFR[11]。EGFR靶向單克隆抗體-西妥昔單抗是唯一的分子靶向劑，已廣泛用于評價NSCLC的化療效果[12,13]。西妥昔單抗加鉑類化療可以作為晚期NSCLC伴有EGFR高度表達(dá)患者治療選擇的一個新的一線治療標(biāo)準(zhǔn)[14]。EGFR-TKI——吉非替尼（Gefitinib，易瑞沙）和厄洛替尼（Erlotinib，特羅凱）是第一類用于治療肺癌的臨床靶向藥物[15]。EGFR基因突變存在于大部分對吉非替尼或厄洛替尼敏感的NSCLC中。EGFR基因突變與NSCLC對TKI的敏感性增高有關(guān)。在EGFR突變的NSCLC中，EGFR-TKI通過上調(diào)BIM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。此外，有數(shù)據(jù)[9]顯示BIM的上升程度與凋亡細(xì)胞的數(shù)量成正比，BIM決定了肺癌細(xì)胞對TKIs的凋亡敏感性。從一系列EGFR突變的肺癌中評估bim mRNA，F(xiàn)aber等[17]證實，bim可作為EGFR-TKIs敏感性的相關(guān)標(biāo)記物。此外，吉非替尼的治療效果顯示，bim表達(dá)水平低且有EGFR突變的肺癌患者治療反應(yīng)差[17]。這些結(jié)果表明，對于EGFR突變的NSCLC尤其是對于突變且TKI抑制劑二次耐藥的NSCLC，提高bim的表達(dá)水平或激活它下游的靶點很可能是一個有前景的治療策略[9]。

Bim的表達(dá)和降解主要受MEK（MAP2K）-ERK（MAPK）信號通路調(diào)控，最近研究[18]表明MEK-ERK信號通路負(fù)性調(diào)節(jié)bim的表達(dá)（圖1）。Bim的表達(dá)可增強(qiáng)MEK-ERK信號通路的抑制作用[19]。TKI誘導(dǎo)的bim表達(dá)上調(diào)是對TKI敏感的NSCLC細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制，而TKI作用后bim表達(dá)無上調(diào)或較少上調(diào)很可能是肺癌細(xì)胞耐藥的重要原因。因此，通過BIM調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡可作為治療腫瘤的新途徑。Bim基因多態(tài)性的缺失被認(rèn)為是EGFR-TKIs內(nèi)在耐藥性的新機(jī)制[20]。這種多態(tài)性的缺失使含BH3結(jié)構(gòu)域的BIM蛋白質(zhì)亞型的表達(dá)減少、凋亡誘導(dǎo)失敗，導(dǎo)致有EGFR突變的NSCLC患者對EGFR-TKI療效下降、無進(jìn)展生存期縮短和疾病控制率降低；而且值得注意的是，這種個體突變只發(fā)生在東亞人群[21]。

2.2 Bim表達(dá)與抑制腫瘤血管生成的相關(guān)性 血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必備條件，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF） 及其受體（VEGFR）有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性、促進(jìn)血管支持物的生成和抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡等作用。VEGF系統(tǒng)還可以通過使用特異性酪氨酸激酶抑制劑或單克隆抗體有針對性地抑制VEGFR。無論是藥物導(dǎo)致的腫瘤體積縮小或VEGF-A的直接阻滯所引起的VEGF-A缺乏，BCL-2家族BH3-only促凋亡成員bim在血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell, EC）的表達(dá)均上調(diào)[22]。更重要的是，VEGF-A拮抗劑抑制腫瘤生長需要BIM誘導(dǎo)的EC凋亡[22]。新的抗癌藥物如貝伐單抗（Avastin，基因泰克），是針對VEGF的人源化單克隆抗體，可阻斷VEGFR信號，引起EC凋亡和血管退化，已被批準(zhǔn)用于一些晚期惡性腫瘤的治療[23]。貝伐單抗、紫杉醇和卡鉑（PCB）聯(lián)合使用的患者，其中位生存期為12.3個月，而且PCB能提高非鱗狀NSCLC患者的緩解率（35%），PCB目前已成為晚期非鱗狀NSCLC患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案[24]。其中，紫杉醇（Paclitaxel）可直接抑制BIM磷酸化和降解，提高BIM蛋白的作用（圖1）。Wang等[25]報道，微血管侵襲是NSCLC的腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期的重要指標(biāo)，同時也可能增加患者復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險。因此，肺癌血管生成的研究為肺癌治療開辟了一條新途徑?；赩EGF在腫瘤血管與正常血管表達(dá)水平的差異，可以其兩者的差異為靶點，阻斷新生血管的形成并破壞已形成的血管，從而達(dá)到腫瘤治療的目的。

圖 1 促凋亡蛋白BIM（BCL211）關(guān)系圖（據(jù)文獻(xiàn)[37]修改）Fig 1 Pro-apoptotic protein BIM(BCL211) diagram (modified according to reference [37])

2.3 Bim表達(dá)與其轉(zhuǎn)錄因子FOXO3（forkhead box protein 3）的關(guān)系 FOXO3是FOXO家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有抑制功能。PIK3CA/AKT1/FOXO3/BIM信號通路在多種惡性腫瘤中存在，包括NSCLC[26]。FOXO3轉(zhuǎn)錄因子是PIK3CA/AKT1信號通路的重要信號分子，此通路對FOXO3的表達(dá)有一定的負(fù)性調(diào)控作用，可導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)FOXO3的磷酸化和降解（圖1）。有研究[27-29]表明，在NSCLC、肝癌、胃癌及原發(fā)性乳腺癌中均發(fā)現(xiàn)FOXO3磷酸化和降解，其中FOXO3的磷酸化和降解還與乳腺癌的低生存率相關(guān)。通過調(diào)控FOXO3的活性和分布，可促進(jìn)bim的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的凋亡，增加NSCLC對抗腫瘤藥物的敏感性。紫杉醇和PIK3CA或AKT1抑制劑曲西立濱（Tricirbine）通過抑制AKT1能夠減少FOXO3的磷酸化和降解并引起FOXO3核易位，從而導(dǎo)致bim基因的活化和轉(zhuǎn)錄。

FOXO3也是藥物AZD6244（Selumetinib，司美替尼）的靶點。AZD6244能夠增強(qiáng)FOXO3的表達(dá)，進(jìn)一步提高bim表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。AZD6244也被稱為ARRY-142886，為MAP2K小分子抑制劑（圖1）。當(dāng)AZD6244與多西紫杉醇聯(lián)合被用于晚期肺癌患者II期臨床試驗時，患者中位生存期相對延長[37]。而且，如果敲除FOXO3及其下游的凋亡基因bim，AZD6244抑制腫瘤生長的功能減弱[30]。Yang等[30]觀察到對AZD6244耐藥的腫瘤，其細(xì)胞核的FOXO3受損，同時減弱了FOXO3所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄活性，而且在治療后FOXO3的靶基因bim表達(dá)下調(diào)。以上證據(jù)均提示，PIK3CA/AKT1/FOXO3/BIM信號通路在腫瘤治療中起著重要作用，為NSCLC多靶點治療提供了新思路。

3 BH3-only蛋白模擬劑與NSCLC靶向治療

ABT-737是由Abbott公司研發(fā)的最成功和最具有開發(fā)潛力的BH3模擬化合物[31]。BH3模擬劑ABT-737能夠與BCL-2、BCL-XL和BCL-W結(jié)合，但不能與MCL-1或A1結(jié)合[32]。在MCL-1被NOXA中和時，ABT-737可引起B(yǎng)AX/BAK依賴的細(xì)胞色素C在體外釋放[33]。有研究[16]表明，bim基因多態(tài)性缺失和EGFR突變的NSCLC對吉非替尼所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有低度敏感性。而BH3-模擬劑ABT-737參與的腫瘤治療可以極強(qiáng)地抑制BCL-2和BCL-XL，增強(qiáng)TKI誘導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)和細(xì)胞死亡[16,34]。BH3模擬物ABT-737增強(qiáng)了厄洛替尼所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的敏感性[35]。因此，EGFR-TKI二次耐藥的NSCLC患者聯(lián)合使用BH3-模擬劑，能夠在增強(qiáng)治療效果的同時減少耐藥性和不良反應(yīng)，這很可能是一種新型的治療方法。

化學(xué)抑制劑ABT-263（navitoclax）是第二代小分子BCL-2蛋白家族口服抑制劑[36]，藥物機(jī)制類似于ABT-737。ABT-263（navitoclax）能夠阻止BCL-XL的結(jié)合并抑制促凋亡蛋白與MAP2K抑制劑的結(jié)合，在許多突變體細(xì)胞系中引起細(xì)胞凋亡[37]。Corcoran等[38]在braf基因突變的結(jié)直腸癌中研究發(fā)現(xiàn)，抑制EGFR的活性能阻止ras基因的活化，而且BRAF和EGFR抑制劑聯(lián)合應(yīng)用使MAPK（mitogen-activated protein kinase）信號活化受阻，增強(qiáng)了抗腫瘤治療的效果。這提示我們，在k-ras或braf基因突變的NSCLC中，BRAF和EGFR抑制劑聯(lián)合使用，很可能是一種有前途的治療策略。MAP2K抑制劑與藥物ABT-263合用是對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷力的治療，其直接靶點是BIM[39]。而且，ABT-263與MEK（MAP2K）抑制劑合用能夠在不同組織中誘導(dǎo)k-ras基因突變的腫瘤細(xì)胞凋亡[39]?？傊?，BH3模擬劑能夠通過抑制BCL-2家族抗凋亡成員BCL-XL，間接激活BAX，從而引起細(xì)胞色素C釋放以及隨后的半胱天冬酶的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。BH3-only蛋白對于腫瘤治療是至關(guān)重要的[40]。

4 展望

了解細(xì)胞凋亡途徑和與之相關(guān)的分子機(jī)制尤其是BIM的作用機(jī)制，研究提高細(xì)胞凋亡敏感性的方法或直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對于腫瘤的治療具有重要意義。在探討B(tài)IM能否成為臨床NSCLC防治的參考指標(biāo)的同時更要思考，是否可以通過人工調(diào)節(jié)bim基因的活性達(dá)到對NSCLC的治療作用。在對bim基因進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)上，減少抗腫瘤藥物的耐藥性和不良反應(yīng)同時不影響機(jī)體正常的組織細(xì)胞而達(dá)到最佳治療效果是我們的共同目標(biāo)。然而，與腫瘤凋亡信號通路相關(guān)的小分子靶向藥物仍存在著多種局限和不足。肺癌易發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移[41]，目前，在惡性腫瘤的化學(xué)治療中，抗腫瘤藥物的毒副作用大以及耐藥等不足限制了其進(jìn)一步的發(fā)展，而且腫瘤通常會對起初有效的治療產(chǎn)生耐藥性。因此，尋找新的抗腫瘤藥物作用靶點并合成抗腫瘤新藥成為腫瘤防治的重點之一。另外，未來的NSCLC靶向治療將強(qiáng)調(diào)針對多個途徑不同靶點的組合治療，以期實現(xiàn)最大的藥物療效并且避開單獨用藥的不良反應(yīng)和耐藥性。