鄭麗雪,劉夢(mèng)瀅,王立梅,齊斌,*
(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500;2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇常熟 215500)
不同發(fā)酵時(shí)期添加金屬離子對(duì)釀酒酵母合成谷胱甘肽的影響
鄭麗雪1,2,劉夢(mèng)瀅1,王立梅1,2,齊斌1,*
(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500;2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇常熟 215500)
摘 要:通過(guò)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),研究了Cu2+,Mg2+,K+,F(xiàn)e2+,Mn2+5種金屬離子在不同發(fā)酵時(shí)間添加對(duì)釀酒酵母CS10515-1 生產(chǎn)谷胱甘肽的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在發(fā)酵初期(0 h),當(dāng) K+、Mg2+、Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L時(shí),GSH的產(chǎn)量分別為88.53、52.73、41.42 mg/L,相比空白對(duì)照分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。在15 h時(shí),當(dāng)Mg2+添加量為0.09 g/L時(shí),GSH產(chǎn)量為61.75 mg/L,比對(duì)照組提高82.01%。當(dāng)發(fā)酵至24 h時(shí),金屬離子的添加對(duì)GSH的產(chǎn)量無(wú)明顯促進(jìn)作用。
關(guān)鍵詞:谷胱甘肽;釀酒酵母;金屬離子
谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過(guò)肽鍵縮合而成的三肽化合物,其分子中含有γ-谷氨酰基和活性巰基,是GSH許多重要生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1],例如:它是許多酶反應(yīng)的輔基,可作為抗氧化劑[2]保護(hù)生物分子蛋白的巰基,清除體內(nèi)過(guò)多的自由基,參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)以及糖代謝,具有預(yù)防糖尿病以及消除疲勞等作用[3-4]。
目前,利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH是最具潛力的方法[5]。GSH在生物體內(nèi)的合成由兩步依靠ATP的酶促反應(yīng)構(gòu)成,這兩步反應(yīng)都需要ATP和金屬離子的參與[6]。另外金屬離子對(duì)于酵母體內(nèi)高效大量的合成ATP也有顯著影響[7]。因此,從金屬離子添加角度考察發(fā)酵過(guò)程谷胱甘肽產(chǎn)量有十分重要的意義。本文考察了在不同時(shí)間添加不同濃度的 Cu2+,Mg2+,K+,F(xiàn)e2+,Mn2+對(duì)釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的影響,旨在為以后的放大實(shí)驗(yàn)提供理論參考。
本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)化學(xué)誘變選育的釀酒酵母CS10515-1。
UV-1240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):日本島津公司;Milli-QAdvantage超純水儀;美國(guó)Millipore公司;XSIO5DU型電子天平:瑞士梅特勒-托利多公司;CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī):日本日立公司。
斜面培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基[12];種子培養(yǎng)基:5°B′e 麥芽汁;發(fā)酵培養(yǎng)基:5°B′e麥芽汁。
麥芽汁制備方法同文獻(xiàn)[8]。本實(shí)驗(yàn)中,將制備好的 10°B′e 麥芽汁用波美計(jì)調(diào)配成 5°B′e。
將活化好的一級(jí)種子以10%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入二級(jí)種子培養(yǎng)基中,30℃、180 r/min培養(yǎng)18 h,然后以10%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,溫度30℃、180 r/min培養(yǎng)33 h。
分別考察0、15、24 h向發(fā)酵液中添加0.09 g/L的CuSO4、MgSO4、KCl、FeSO4、MnSO45 種 金 屬 鹽 對(duì) GSH產(chǎn)量及生物量的影響。確定對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量有促進(jìn)作用的金屬離子,然后優(yōu)化金屬離子的最佳添加量。以不添加金屬離子作為空白對(duì)照,每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。
生物量測(cè)定[8];殘?zhí)橇繙y(cè)定[9];GSH 產(chǎn)量測(cè)定[8]。
根據(jù)搖瓶發(fā)酵曲線,GSH的整個(gè)搖瓶發(fā)酵過(guò)程分為3個(gè)階段,分別是指數(shù)生長(zhǎng)期(0~18h),平穩(wěn)期(18 h~26 h),細(xì)胞衰亡期(26 h~48 h)。由于谷胱甘肽為釀酒酵母的次級(jí)代謝產(chǎn)物,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至平穩(wěn)期時(shí)大量合成,因此分別考察了不同細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期添加不同濃度的金屬離子對(duì)于細(xì)胞合成谷胱甘肽的影響。
2.1.1 發(fā)酵初始添加金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響
發(fā)酵初始添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對(duì) GSH 產(chǎn)量的影響及生物量影響見(jiàn)圖1。
由圖1可知,發(fā)酵初期添加Mg2+、Fe2+、K+及Mn2+對(duì)GSH產(chǎn)量都有促進(jìn)作用,此結(jié)論與Chi-Hsien Liu[10]、Tao Zhang[11]、Tan Zuo-Ping[12]、Jae-Young Cha[13]等在關(guān)于谷胱甘肽培養(yǎng)基優(yōu)化的研究中的結(jié)論是一致的??赡苡捎谠诎l(fā)酵初期細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)初期,細(xì)胞代謝較為迅速,酶系較為活躍,上述幾種金屬離子作為某些酶類的激活劑[14],能夠在一定程度上提高酶的活力,從而促進(jìn)GSH的合成。
圖1 不同金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量和細(xì)胞生物量的影響(0 h)Fig.1 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass
在此基礎(chǔ)上,分別考察了對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量有顯著提高作用的3種金屬離子的最佳添加量,優(yōu)化后結(jié)果表明,當(dāng) K+,Mg2+,F(xiàn)e2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L時(shí),GSH 的產(chǎn)量分別為88.53、52.73、41.42 mg/L,相比空白對(duì)照組分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。
2.1.2 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期(15 h)添加不同金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期(15 h)添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響見(jiàn)圖2。
圖2 不同金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及細(xì)胞生物量的影響(15 h)Fig.2 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass
由圖2可知,發(fā)酵至15 h時(shí),發(fā)酵液中添加Mg2+對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量都有明顯的促進(jìn)作用,Mg2+的添加使GSH產(chǎn)量達(dá)到76.76 mg/L,相比對(duì)照組提高了39.70%。在釀酒酵母體內(nèi),GSH作為次級(jí)代謝產(chǎn)物在細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí)大量合成,GSH生物合成由兩步依靠ATP的酶促反應(yīng)構(gòu)成,而且在反應(yīng)時(shí)需要Mg2+的參與[6],所以當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期時(shí)向發(fā)酵液中添加Mg2+比發(fā)酵初始添加效果更好。進(jìn)一步優(yōu)化Mg2+添加量,最適添加量為0.09 g/L。
2.1.3 穩(wěn)定期(24 h)添加不同金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響
穩(wěn)定期(24 h)添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對(duì) GSH產(chǎn)量及生物量的影響見(jiàn)圖3。
圖3 添加金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量和細(xì)胞生物量的影響(24 h)Fig.3 The influence of different metal ions on GSH production and biomass
由圖3可知,當(dāng)發(fā)酵至24 h時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期,此時(shí)向發(fā)酵液中添加金屬離子對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量都起到了抑制作用,其中Cu2+對(duì)其影響最大。穩(wěn)定期時(shí),發(fā)酵液中的碳源幾乎消耗殆盡,ATP合成量少,對(duì)細(xì)胞中GSH的合成不利因素增多,所以金屬離子的添加對(duì)于谷胱甘肽的合成不起作用,甚至對(duì)細(xì)胞還會(huì)起到毒害作用。如Cu2+可以誘導(dǎo)酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,活性氧可以參與破壞細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性,奪取質(zhì)膜和細(xì)胞器膜中不飽和脂肪酸的氫離子引起膜脂過(guò)氧化[15]。
本文研究了當(dāng)細(xì)胞處于不同生長(zhǎng)時(shí)期向發(fā)酵液添加金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響。結(jié)果表明:
在發(fā)酵初始(0 h)添加 Mg2+、K+、Fe2+有利于促進(jìn)GSH 的合成。當(dāng) K+、Mg2+、Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L 時(shí),GSH 的產(chǎn)量分別為 88.53、52.73、41.42 mg/L,相比空白對(duì)照分別提高了63.5%、36.58%和44.25%。
當(dāng)發(fā)酵至15 h,發(fā)酵液中添加Mg2+對(duì)GSH產(chǎn)量有促進(jìn)作用,當(dāng)Mg2+添加量為0.09 g/L時(shí),GSH產(chǎn)量達(dá)最大,為61.75 mg/L,比對(duì)照組提高82.01%。
當(dāng)發(fā)酵至24 h時(shí),5種金屬離子對(duì)釀酒酵母合成谷胱甘肽及生物量均無(wú)促進(jìn)作用。
金屬離子對(duì)于酵母體內(nèi)高效大量的合成ATP有顯著影響,進(jìn)而對(duì)于生物體內(nèi)谷胱甘肽的合成影響很大,所以研究金屬離子的添加對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量的影響為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。從上述結(jié)果看,不同階段銅離子的添加都對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量起到了抑制作用,而杜君等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,適宜濃度的銅離子可以氧化脅迫釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)過(guò)量積累谷胱甘肽,所以,對(duì)于不同的菌種,起到正向脅迫作用的銅離子的濃度會(huì)相差很大,有待于我們進(jìn)行進(jìn)一步的研究,另外,在以后的實(shí)驗(yàn)中可以考慮將起到脅迫和輔酶作用的金屬離子同時(shí)添加去提高谷胱甘肽產(chǎn)量,為后續(xù)的放大實(shí)驗(yàn)及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
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Effects of Metal Ions on Glutathione Production by Saccharomyces Cerevisiae under Different Fermentation Times
ZHENG Li-xue1,2,LIU Meng-ying1,WANG Li-mei1,2,QI Bin1,*
(1.College of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,Jiangsu,China;2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology,Changshu 215500,Jiangsu,China)
Abstract:The effect of Cu2+,Mg2+,K+,F(xiàn)e2+,Mn2+under different fermentation times on GSH fermentation by saccharomyces cerevisiae CS10515-1 were investigated in this paper.It was found that GSH production was 88.53 mg/L,52.73 mg/L,41.42 mg/L respectively,which increasing by 63.50%,36.58%and 44.25%than the controls under the conditions of adding amount was 0.15 g/L K+,0.12 g/L Mg2+and 0.09 g/L Fe2+at 0 hour.GSH production was 61.75 mg/L,which increasing 82.01%under the conditions of 0.09 g/L Mg2+at 15h.Metal ions's adding had no effect on GSH production at 24 h.
Key words:glutathione;Saccharomyces cerevisiae;metal ion
DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.027
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171758);2011年度常熟理工學(xué)院“青藍(lán)工程”優(yōu)秀青年骨干教師培養(yǎng)對(duì)象
鄭麗雪(1982—),女(漢),實(shí)驗(yàn)師,碩士,研究方向:食品生物技術(shù)。
齊斌(1965—),男(漢),研究員,博士,研究方向:糧食油脂與植物蛋白工程。
2013-01-05