劉 煒， 劉 紅

(海南師范大學 化學與化工學院， ?？?571158)

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葒草苷與DNA相互作用的機理研究

劉 煒*， 劉 紅

(海南師范大學 化學與化工學院， ?？?571158)

應用熒光探針、紫外光譜技術(shù)和黏度法研究了葒草苷和DNA分子間的相互作用.研究結(jié)果表明，在pH為7.4的Tris-HCl緩沖體系中，葒草苷可將鹽酸小檗堿從DNA雙螺旋中擠出，導致其熒光猝滅.根據(jù)熱力學參數(shù)確定了葒草苷與DNA主要以疏水作用力結(jié)合；25℃和40℃兩個不同溫度下葒草苷與DNA之間的結(jié)合常數(shù)分別為1.541×103L·mol-1和1.602×103L·mol-1， 結(jié)合位點數(shù)分別為0.7888和0.7242；黏度實驗進一步證明葒草苷是以嵌入結(jié)合的方式與DNA結(jié)合.

葒草苷； DNA； 相互作用； 光譜

DNA是細胞和病毒的重要組成部分，是重要的遺傳物質(zhì).藥物與DNA發(fā)生作用可能會影響到DNA的轉(zhuǎn)錄和復制，從而起到抗癌、抑菌和抗病毒的作用.研究藥物分子與DNA的作用，可以從分子水平上闡明藥物的藥效，對藥物分子合成與設計具有重要意義.以DNA作為藥物作用靶是有效的新興的藥物篩選和新藥設計研究方法[1-2].

葒草苷屬于黃酮苷類化合物，存在于金蓮花、葫蘆巴、竹葉等植物中，具有抗氧化、抗癌、抗病毒的藥理活性，其分子式如圖1.有關(guān)其與DNA的相互作用研究尚未見報道，因此，本文主要通過紫外吸收光譜法、熒光光譜法研究葒草苷與DNA相互作用的機理.

圖1 葒草苷結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of orientin

1實驗部分

1.1儀器與試劑

TU-1901紫外可見分光光度計(普析通用)，PHS-25型pH計(上海雷磁)，日立F-4500熒光分光光度儀(日本)．

DNA 貯備液：稱取0.1 g的鯡魚精DNA(Sigma公司)以二次蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中，由在260 nm處的吸光度(ε=6 600 L·mol-1·cm-1)確定其濃度，冰箱中冷藏.

葒草苷(中檢所，純度≥99.8%)貯備液:稱取一定量的葒草苷，用乙醇定容至100 mL的容量瓶中配制成濃度為10-3mol/L，置于0～4℃下保存.

0.1 mol/L pH7.4的Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖溶液.

1.2實驗方法

在10 mL容量瓶中依次加入1.0 mL的緩沖溶液、0.4 mL DNA和不同量的葒草苷，定容、搖勻，以試劑空白為參比，進行紫外吸收光譜的測定.

在10 mL的容量瓶中依次加入1.0 mL的緩沖溶液、0.2 mL小檗堿、DNA溶液，以及不同量的葒草苷工作溶液，定容、搖勻，進行熒光光譜的測定.熒光激發(fā)波長定為358 nm，熒光發(fā)射峰位為532 nm，狹縫寬均為5 nm.

2結(jié)果與討論

2.1葒草苷對DNA紫外吸收光譜的影響

圖2為葒草苷對DNA紫外吸收光譜的影響.從圖2中可以看出，DNA在257 nm處有一最大紫外吸收峰，連續(xù)加入葒草苷后，其吸收度持續(xù)增強，表明DNA發(fā)生了增色效應.由于DNA在257 nm處的吸收峰來自于其堿基對間的電子傳遞，這說明葒草苷可能嵌入到DNA雙螺旋中，改變了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，影響了堿基對間的電子傳遞，從而發(fā)生了增色效應.

(pH=7.4; CDNA=1.2×10-4 mol/L; a→e:Corientin=0，2，4，6，8×10-5 mol/L) 圖2 葒草苷對DNA紫外吸收光譜的影響Fig.2 The UV absorption spectra of DNA in the presence of orientin

2.2葒草苷對BR-DNA體系熒光光譜的影響

鹽酸小檗堿(BR)可作為熒光探針研究小分子化合物與DNA的相互作用，當藥物小分子插入到DNA雙螺旋中時，可與小檗堿發(fā)生競爭結(jié)合DNA的反應，將小檗堿從雙螺旋中擠出，從而熒光強度降低[3-4].連續(xù)向小檗堿-DNA體系中加入不同量的葒草苷，實驗結(jié)果如圖3所示，小檗堿-DNA體系在532 nm處有一顯著熒光發(fā)射峰，隨著葒草苷的連續(xù)加入，其熒光強度持續(xù)下降，說明葒草苷對小檗堿-DNA體系發(fā)生了熒光猝滅作用.

2.3熒光猝滅方式的判斷

將葒草苷對BR-DNA的猝滅光譜所得熒光強度代入動態(tài)猝滅Stern-Volmer方程[5]:

F0/F=1+Kqτ0c=1+Ksvc，

(1)

求得在298 K時， 葒草苷對BR-DNA的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Ksv為1.2125×104L/moL， 則其雙分子速率常數(shù)Kq為1.2125×1012L·mol-1·s-1(DNA等生物大分子的τ0約為10-8s-1)，遠大于生物大分子最大動態(tài)猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1[6]，因此葒草苷對BR-DNA的熒光猝滅是因為形成復合物所產(chǎn)生的靜態(tài)猝滅(圖4).實驗結(jié)果表明，葒草苷與DNA是以嵌入方式結(jié)合，導致小檗堿被擠出DNA雙螺旋，從而發(fā)生熒光猝滅.

(pH=7.4; CBR=2×10-5mol/L; CDNA=6×10-5mol/L; a→h:Corientin=0， 1， 2， 3， 5， 6， 7， 8×10-5mol/L)圖3 葒草苷對小檗堿-DNA體系熒光 發(fā)射光譜的影響Fig.3 The fluorescence emission spectra of BR-DNA in the presence of orientin

(pH=7.4; CBR=2×10-5 mol/L; CDNA=6×10-5 mol/L) 圖4 葒草苷-BR-DNA的stern-volmer方程Fig.4 Stern-Volmer curves for the binding of orientin to BR-DNA at 298 K

2.4葒草苷與DNA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

由靜態(tài)猝滅公式[7]

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlgcM,

(2)

分別作出不同溫度下葒草苷-DNA體系的關(guān)系圖.結(jié)果如圖5，通過外推截距和斜率可求出25℃和40℃葒草苷與DNA之間的結(jié)合常數(shù)分別為1.541×103L·mol-1和1.602×103L·mol-1，結(jié)合位點數(shù)分別為0.7888和0.7242.

(pH=7.4; CBR=2×10-5 mol/L; CDNA=6×10-5 mol/L; a:25℃，b:40℃)圖5 葒草苷與 DNA反應的 lg[(F0 -F)/F]～lgC關(guān)系圖Fig.5 The plot of lg[(F0 -F)/F] vs lgC of the reaction between orientin and DNA

2.5葒草苷與DNA結(jié)合反應的熱力學性質(zhì)及作用力的影響

根據(jù)熱力學公式可以計算藥物小分子與生物大分子作用間的有關(guān)熱力學參數(shù)[8-9]:

ln(K2/K1)=ΔHm(1 /T1-1 /T2) /R，

(3)

ΔGm=-RTlnK，

(4)

ΔSm=(ΔHm-ΔGm) /T .

(5)

根據(jù)熱力學參數(shù)可以簡單判斷其相互作用類型：ΔH > 0及ΔS > 0為疏水作用，ΔH < 0及ΔS > 0為靜電作用，ΔH < 0及ΔS < 0為氫鍵或者范德華作用[10-12].

根據(jù)葒草苷與DNA的結(jié)合常數(shù)可以求得二者結(jié)合過程的熱力學參數(shù):

ΔHm=2023J·mol-1，

ΔGm(298K)=-18.17kJ·mol-1，

ΔSm(298K)=67.76J·K-1·mol-1.

由此可判斷葒草苷與DNA主要是以疏水作用力結(jié)合.

2.6葒草苷與DNA反應的黏度研究

當藥物分子以嵌入的方式與DNA結(jié)合，則DNA雙螺旋變長，黏度增加[10，13].向固定濃度的DNA溶液中加入不同量的葒草苷，由實驗結(jié)果按下式計算相對黏度：

η=(t-t0)/t0，

式中t0為空白溶液流經(jīng)毛細管所需時間，t為含不同量葒草苷的DNA溶液流經(jīng)毛細管所需時間，以(η/η0)1/3對結(jié)合比率r(Corientin/CDNA)作圖，η0為未加入葒草苷時DNA的黏度[10]，如圖6所示，隨著葒草苷濃度的增大，DNA相對黏度逐漸增高，由此可知葒草苷與DNA以嵌入方式結(jié)合，結(jié)果與熒光、紫外光譜結(jié)果相吻合.

(pH=7.4; CDNA=3×10-4mol/L)圖6 葒草苷對DNA相對黏度的影響Fig.6 The effect of orientin on the relative viscosity of DNA

3結(jié)論

本論文利用熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了葒草苷與DNA相互作用的機理，實驗結(jié)果表明，葒草苷與DNA主要通過疏水作用力以嵌入模式結(jié)合，從而改變了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，影響了其復制，這可能是其具有抗癌、抗病毒活性的原因之一.25℃和40℃兩個不同溫度下下葒草苷與DNA之間的結(jié)合常數(shù)分別為1.541×103和1.602×103L·mol-1，結(jié)合位點數(shù)分別為0.788 8和0.724 2.

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Study on the interaction of orientin and DNA

LIU Wei， LIU Hong

(College of Chemistry and Chemical Engineering， Hainan Normal University， Haikou 571158)

The interaction of orientin and DNA was studied using fluorescent probe， UV spectrometry and viscosity method. The results showed that orientin can extrude berberine hydrochloride(BR) from the DNA double helix and cause the decrease of the fluorescence intensity. The main binding force between orientin and DNA is hydrophobic force according to thermodynamic parameters. The binding constantKat 25℃ and 40℃ were calculated as 1.541×103and 1.602×103L·mol-1， and the binding sites numbernas 0.7888 and 0.7242， respectively. The viscosity experiments further proved that orientin binds with DNA in a mode of intercalative binding ．

orientin; DNA; interaction; spectrometry

2014-03-09.

海南省教育廳資助項目(Hjkj2012-22).

1000-1190(2014)04-0528-04

O657.32

A

*E-mail: liuwei1224@126.com.