黃芩 李東明 孫婷婷 尚盼盼 葛杰 付又剛

(北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科，北京 100191)

馬爾尼菲青霉病 (penicilliosis marneffei，PSM)是發(fā)生于艾滋病患者的機(jī)會性真菌感染，主要流行于東南亞及我國南部地區(qū)，多以發(fā)熱、貧血、體重下降、淋巴結(jié)及肝脾腫大等非特異性癥狀就診，非流行地區(qū)患者易被漏診或誤診。PSM常出現(xiàn)的皮膚癥狀包括軟疣樣損害、丘疹、結(jié)節(jié)、皮膚壞死等［1］。晚期無皮膚癥狀者較少見。筆者診斷了1例無皮膚損害的PSM，患者表現(xiàn)為發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、白細(xì)胞減少等癥狀，以血液及骨髓涂片中發(fā)現(xiàn)真菌孢子為線索，經(jīng)培養(yǎng)確診為真菌血癥及艾滋病。形態(tài)學(xué)及DNA鑒定為馬爾尼菲青霉病?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

患者男性，39歲，建筑工人，未婚，四川人，在廣東工作10余年，因“發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大1個(gè)月”于2012年10月就診?；颊?個(gè)月前無明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，伴輕度咳嗽，無痰。表現(xiàn)為稽留熱，不伴寒顫，體溫最高40℃，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院以“上呼吸道感染”予抗生素(具體不詳)治療后咳嗽消失，體溫曾降至正常。數(shù)日后上述癥狀加重，表現(xiàn)為持續(xù)高熱，伴惡心、嘔吐、輕度腹瀉等消化道癥狀，并漸出現(xiàn)多發(fā)淺表淋巴結(jié)腫大?；颊咴驮\于多家醫(yī)院，檢查發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板進(jìn)行性減少，因骨髓涂片見可疑真菌孢子轉(zhuǎn)入我科?；颊呒韧w健，有冶游史。發(fā)病以來體重減輕約2 kg。

體格檢查:體溫40℃，呼吸21次/min，脈搏90次/min，血壓110/70 mmHg。急性病容，神志清楚。雙側(cè)腹股溝可及多個(gè)綠豆至蠶豆大腫大淋巴結(jié)，質(zhì)韌，境界清楚，活動(dòng)度可，無壓痛，余淋巴結(jié)未觸及腫大。腹軟，無壓痛及反跳痛，肝肋下未觸及，脾肋下約2 cm。?？撇轶w未見皮疹。輔助檢查:B超:肝區(qū)未見明顯異常，脾臟稍大，雙側(cè)腹股溝多發(fā)腫大淋巴結(jié)。血常規(guī):白細(xì)胞1.76×109/L，中性粒細(xì)胞百分比89.8%，淋巴細(xì)胞百分比4.5%，紅細(xì)胞2.88 ×1012/L，血紅蛋白 96 g/L，血小板 43 ×109/L;尿常規(guī):潛血2+，尿蛋白2+;紅細(xì)胞沉降率43 mm/h;C反應(yīng)蛋白:9.26 mg/dl;肝功能:ALT 57 IU/L，AST 132 IU/L，γ-GT 306 IU/L，白蛋白 27 g/L;腎功能:BUN 21.2 mmol/L，Cr 192 mmol/L;血鉀:4.87 mmol/L;免疫球蛋白:IgG 16.4 g/L，IgA 6.76 g/L，IgE 1 078 IU/mL;凝血功能:PT 15.3 s，INR 1.33，F(xiàn)ib 1.61 g/L，D-dimer 0.56 μg/mL;血利士曼原蟲抗體陰性，瘧原蟲陰性;抗ENA、ANA、ds-DNA及ANCA相關(guān)抗體陰性。抗HIV抗體初篩及確認(rèn)試驗(yàn)陽性。

1.2 骨髓涂片檢查

進(jìn)行骨髓穿刺并行骨髓涂片檢查(瑞氏染色)。

1.3 血液培養(yǎng)瓶培養(yǎng)

取患者外周血行需氧及厭氧血培養(yǎng)。

1.4 真菌學(xué)檢查及菌種鑒定

將患者外周靜脈血標(biāo)本分別無菌接種于沙氏培養(yǎng)基(SDA)和腦心浸液培養(yǎng)基 (BHI)27℃培養(yǎng)，48 h后挑取菌落轉(zhuǎn)種馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)27℃培養(yǎng)5 d，并行小培養(yǎng)觀察顯微鏡下結(jié)構(gòu)。

1.5 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

DNA提取 采用CTAB法提取總基因組DNA。選取營養(yǎng)菌絲置于滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，磨碎后，向 Eppendorf管加入 600 μL已在65℃預(yù)熱的CTAB提取液，混勻后置入65℃的水浴中保溫1 h。向Eppendorf管加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。吸取上清液轉(zhuǎn)至新的1.5 mL Eppendorf管，加入等體積氯仿/異戊醇，混勻，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。吸取上清轉(zhuǎn)至新的1.5 mL Eppendorf管，加入4/5體積的異丙醇，混勻后置于-20℃沉淀30 min，4℃下12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清，加入500 μL 70%乙醇，清洗DNA沉淀。室溫干燥10 min，加入40 μL TE緩沖液，溶解DNA。

PCR反應(yīng) 使用真菌通用引物 ITS4:5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ＇，ITS5:5 ＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3＇。PCR 反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性 5 min，95℃ 變性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 8 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

DNA測序 將PCR產(chǎn)物送北京華大基因公司進(jìn)行堿基序列測定。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓涂片檢查

可見厚壁分隔真菌孢子(瑞氏染色)(見圖1)。

2.2 血液培養(yǎng)瓶培養(yǎng)

培養(yǎng)結(jié)果為真菌生長。

2.3 真菌學(xué)檢查

患者外周靜脈血標(biāo)本分別無菌接種于沙氏培養(yǎng)基(SDA)和腦心浸液培養(yǎng)基 (BHI)27℃培養(yǎng)，48 h后可見SDA培養(yǎng)基上有細(xì)小絲狀真菌菌落生長。挑取菌落轉(zhuǎn)種馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDA)27℃培養(yǎng)5 d，可見菌種表面呈黃色粉末狀，該菌產(chǎn)生大量紅色色素將培養(yǎng)基染成深紅色 (見圖2)，顯微鏡下可見典型的帚狀枝 (見圖3)。腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)37℃培養(yǎng)1周，菌落呈酵母樣。初步鑒定為馬爾尼菲青霉，菌株代號為PUTH12102702(Peking University Third Hospital)。

2.4 PCR擴(kuò)增及測序鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查得到預(yù)期的1條約501 bp的DNA片段 (見圖4)。對PCR產(chǎn)物直接測序并進(jìn)行ITS區(qū)序列比對，鑒定為Penicillium marneffei，與標(biāo)準(zhǔn)株CBS 101038(1例來自印度的艾滋病患者)及ATCC201699(1例來自泰國的患者)的一致性為100%。

圖1 骨髓涂片可見巨噬細(xì)胞內(nèi)圓形和卵圓形有明顯分隔的孢子(瑞氏染色，×100) 圖2 菌種表面呈黃色粉末狀，產(chǎn)生大量酒紅色色素(27℃) 圖3 小培養(yǎng)可見典型帚狀枝(乳酸酚棉蘭染色，×100) 圖4 PCR擴(kuò)增結(jié)果:所用引物分別為ITS4及ITS5，擴(kuò)增片段大小為501 bp(C1、C2 樣本提取自培養(yǎng)物菌懸液;D2000 從下到上依次為100 bp，250 bp，500 bp，700 bp，1 000 bp，2 500 bp;Marker從下到上依次為100 bp，200 bp，300 bp，400 bp，500 bp，600 bp)Fig.1 Bone marrow biopsy showed intracellular septate spores in macrophagocyte(Wright＇s staining，× 100)Fig.2 The colonies surface was powdery and yellow-green，revealed red diffusible pigment on PDA(27℃)Fig.3 Typical broom-shaped under microscope(Lactophenol Medan staining，×100)Fig.4 PCR proliferation primers:ITS4 and ITS5;product:a 501 bp sequence(C1，C2:samples from fungi culture suspension;D2000:100 bp，250 bp，500 bp，700 bp，1 000 bp，2 500 bp，respectively;Marker1:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp，500 bp，600 bp，respectively)

2.5 診斷和轉(zhuǎn)歸

本例診斷為艾滋病合并馬爾尼菲青霉敗血癥。給予氟康唑150 mg口服，1次/d。用藥2次后再次行血培養(yǎng)，結(jié)果仍為陽性?；颊咿D(zhuǎn)入傳染病醫(yī)院治療數(shù)日后因病情迅速惡化死亡。

3 討 論

馬爾尼菲青霉病為馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)感染引起的系統(tǒng)性真菌病，1988年P(guān)iehl等首次報(bào)道該病為HIV的合并癥之一［2］。我國部分地區(qū)AIDS患者中PM感染率達(dá)12.3%，而播散型 PM感染者 HIV陽性超過70%，這是診斷 AIDS的重要線索和標(biāo)志之一［3］。本例患者為青年男性，長期在廣東地區(qū)工作，有冶游史，抗HIV抗體初篩及確認(rèn)試驗(yàn)陽性，有系統(tǒng)性機(jī)會致病菌感染的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，艾滋病合并馬爾尼菲青霉敗血癥診斷成立。骨髓及血液涂片在診斷該病中起了重要作用。懷疑PSM時(shí)應(yīng)盡快做HIV檢測，并積極追蹤，以防漏診。

PM可致多系統(tǒng)感染，真菌敗血癥為其經(jīng)血播散的主要途徑。PSM臨床分局限型及播散型兩種，AIDS患者多為播散型感染。臨床表現(xiàn)非特異，包括發(fā)熱 (99%)、貧血 (78%)、嚴(yán)重體重下降(76%)、皮疹 (75%)、廣泛淋巴結(jié)腫大 (58%)及肝脾腫大 (51%)等［4］。本例患者癥狀主要為發(fā)熱、廣泛淋巴結(jié)及脾臟腫大，伴有體重下降，且未出現(xiàn)皮疹，臨床表現(xiàn)非特異。盡管PSM患者骨髓和淋巴結(jié)真菌培養(yǎng)陽性率幾乎為100%，血液培養(yǎng)可達(dá)76%［5］，首先經(jīng)血液診斷的病例仍較少，而經(jīng)血液培養(yǎng)確診的患者多已至發(fā)病晚期，很少能夠接受及時(shí)的抗真菌治療［6］。

PM為胞內(nèi)寄生菌，感染人體后均寄生在單核-吞噬細(xì)胞內(nèi)，被PM激活的CD4+T細(xì)胞可合成和釋放多種細(xì)胞因子，吸引巨噬細(xì)胞聚集并活化，而在CD4+T細(xì)胞減少的個(gè)體中，巨噬細(xì)胞不但不能及時(shí)吞噬和殺滅PM孢子，反而成為其良好的避風(fēng)港和繁殖地，形成播散性感染，引發(fā)PSM［7］。雖然PSM感染途徑尚不清楚，但作為艾滋病的并發(fā)癥，應(yīng)與性接觸或血液感染有關(guān)。本例中血液細(xì)胞中大量的真菌孢子表明該病具有極強(qiáng)的傳染性，對于這種無其他器質(zhì)性損害的患者及時(shí)作出診斷，無論對于阻止其艾滋病毒的傳播，還是PSM的傳播都具有十分重要的意義。

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［3］趙國慶，冉玉平，向耕.中國大陸馬爾尼菲青霉病的臨床表現(xiàn)及流行病學(xué)特征的系統(tǒng)評價(jià)［J］.中國真菌學(xué)雜志，2007，2(2):68-71.

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［7］成先桂.馬爾尼菲青霉與馬爾尼菲青霉?。跩］.中國真菌學(xué)雜志，2008，3(2):112-115.