資海榮，李偉，周丹，李婕，宣楊，郭艷，衛(wèi)平民

(東南大學 公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京 210009)

禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽流感病毒)引起的一種急性傳染病，也能感染人類，被國際獸疫局定為甲類傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟。到目前為止，已報道[1- 6]的可引起人類感染的禽流感病毒有H7N7、H9N2 和H5N1。自從1997年在香港暴發(fā)H5N1以來，此病癥引起世界各國衛(wèi)生組織的高度關(guān)注。以往僅在禽類發(fā)現(xiàn)甲型H7亞型病毒感染，2013年2月底開始，我國東部省市地區(qū)陸續(xù)首次發(fā)現(xiàn)了由甲型H7N9禽流感病毒引起人感染的病例[7]。截至2013年8月30日，新型甲型H7N9禽流感散發(fā)涉及12個城市(包括上海、安徽、浙江、江蘇、廣州、山東、湖南、河南、江西、福建、河北、北京)，確診感染病例達135例，其中死亡病例45例。進一步研究[8]表明，H7N9流感病毒能夠發(fā)生有限的人傳人。

甲型流感病毒系單股負鏈RNA病毒，其基因組包括8個獨立片段：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，它們依次編碼多聚酶成分(PB2、PB1、PA)、血凝素(HA)、核衣殼蛋白(NP)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NEP)[9- 10]。2001年，Chen等[11]在研究MHCⅠ類分子遞呈抗原肽時發(fā)現(xiàn)了一種不屬于流感病毒任何已知開放閱讀框(open reading frame，ORF)編碼的多肽——PB1- F2蛋白，該蛋白是導致甲型流感病毒致病性的關(guān)鍵蛋白之一。 研究[12]顯示，PB1- F2蛋白可以誘導宿主細胞線粒體途徑的細胞凋亡，部分流感病毒毒株的PB1- F2蛋白可以提高流感病毒聚合酶活性，從而促進病毒在宿主細胞中復制。同時，完整的PB1- F2蛋白上存在特異的抗原表位，能誘導宿主體內(nèi)免疫T細胞的表達，引起其免疫水平的改變，這與二次細菌感染引發(fā)的肺損傷具有顯著關(guān)聯(lián)；還發(fā)現(xiàn)隨著基因的進化，有部分甲型流感病毒的亞型在PB1- F2序列上提前出現(xiàn)了終止密碼子，導致PB1- F2蛋白的斷裂，形成PB1- F2長度的多態(tài)性，而且從時間上呈現(xiàn)了一定的進化特征。截短型PB1- F2蛋白仍保留部分功能，如A/Beijing/11/1956(H1N1)；已發(fā)現(xiàn)A/Hong Kong/1/1968(H3N2)的完整PB1- F2蛋白具有促炎癥反應功能，H7N9作為新型甲型流感病毒的亞型之一，其PB1- F2蛋白的進化現(xiàn)狀值得監(jiān)測并探討。本研究收集IRD數(shù)據(jù)庫上的自2013年2月19日到2013年10月31日的H7N9流感毒株63株，利用MEGA 5.2.1軟件進行分析，旨在對新型甲型H7N9流感病毒的PB1基因進化趨勢進行分析，并對H7N9高致病性機制進行探討。

1 資料與方法

1.1 資料來源

流感病毒基因序列通過 The NIAID Influenza Research Database(IRD) online(http://www.fludb.org)獲得，下載自2013年2月19日到2013年10月31日的新型甲型H7N9流感病毒PB1基因序列63條，其中上海22株、江蘇13株、安徽1株、山東7株、廣東2株、浙江8株、湖南2株、江西2株、河南2株、福建2株、臺灣2株；環(huán)境樣本毒株13株，禽流感毒株33株(其中雞源26株，鴨源2株，鴿子源5株)，人流感17株。

1.2 構(gòu)建進化樹

利用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)Version 5.2.1 軟件進行核苷酸序列比對，采用鄰接(neighbor- joining，NJ)法(bootstraps=1 000)繪制H7N9流感病毒PB1基因的系統(tǒng)進化樹，分析2013年新型甲型H7N9流感病毒PB1基因的進化狀況。

1.3 PB1- F2氨基酸位點改變

利用MEGA 5.2.1 軟件進行氨基酸序列比對，對PB1- F2氨基酸位點改變進行分析。

1.4 各型氨基酸構(gòu)成比例

利用MEGA 5.2.1軟件進行氨基酸序列比對，對PB1- F2蛋白中各類氨基酸構(gòu)成比進行運算、輸出。Excell表格對酸性氨基酸、堿性氨基酸、疏水性氨基酸、親水性氨基酸的構(gòu)成比進行計算，利用PASW 18.0 進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 H7N9流感病毒PB1系統(tǒng)進化樹

見圖1。

從圖1 PB1系統(tǒng)進化樹可以發(fā)現(xiàn)，63株新型甲型H7N9流感毒株主要進化為兩大系別，18株病毒株屬于系別Ⅰ，45株病毒株屬于系別Ⅱ。系別Ⅰ與系別Ⅱ之間的核苷酸同源性以及氨基酸同源性分別為 96.3%～100%和98.6%～100%，系別Ⅰ核苷酸同源性以及氨基酸同源性分別為96.8%～100%和98.6%～100%，系別Ⅱ核苷酸同源性以及氨基酸同源性分別為98.5%～100%和99.2%～100%。

2.2 H7N9流感病毒中發(fā)現(xiàn)PB1- F2斷裂株存在

將下載的PB1序列通過MEGA 5.2.1軟件進行比對，在PB1的氨基酸第95～367從起始密碼子ATG的位點到TAA或者TGA的終止密碼子中截選出來，利用MEGA 5.2.1軟件進行氨基酸序列比對，在63株毒株中發(fā)現(xiàn)有17株序列同時在氨基酸第26位提前出現(xiàn)了終止密碼子，導致PB1- F2蛋白在第25位氨基酸后出現(xiàn)斷裂。出現(xiàn)截短型PB1- F2蛋白毒株中分別有環(huán)境樣本6株，其中3株來自山東，2株來自河南，1株來自上海；禽流感8株，其中7株為雞源性，1株為鴿子源性；人流感3株，分別為A/Nanchang/1/2013、A/Changsha/1/2013、A/Changsha/2/2013。具體見圖2。

2.3 H7N9流感病毒的氨基酸位點改變

通過對H7N9流感病毒PB1- F2病毒的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)本研究中的63株毒株中共有23處位點發(fā)生了改變。由圖2可以看出，PB1- F2蛋白截短型毒株基因發(fā)生突變的位點明顯多于PB1- F2蛋白完整型毒株，且PB1- F2蛋白截短型毒株基因的突變位置相對較固定。然而PB1- F2蛋白截短型毒株中A/chicken/Rizhao/875/2013的發(fā)生突變的位點相對于其他毒株要多。完整型PB1- F2蛋白毒株相對較少，卻也同樣存在發(fā)生突變位點較高的毒株，比如A/chicken/Shanghai/S1080/2013發(fā)生突變的位點卻相對較多，此外還有A/chicken/Zhejiang/SD019/2013、A/Guangdong/1/2013、A/duck/Zhejiang/SC410/2013、A/duck/Zhejiang/SC410/2013。

2.4 H7N9流感病毒PB1- F2各類氨基酸構(gòu)成

見表1。

氨基酸根據(jù)其結(jié)構(gòu)與特性可分為疏水性氨基酸、親水性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸[13]，63株流感毒株中構(gòu)成PB1- F2蛋白的各類氨基酸比例見表1。經(jīng)方差分析，完整型PB1- F2蛋白毒株與截短型PB1- F2蛋白毒株的各類氨基酸構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學意義(F1=44.25，P1<0.01；F2=17.83，P2<0.01；F3=719.02，P3<0.01；F4=1 016.19，P4<0.01)(1=疏水性氨基酸，2=親水性氨基酸，3=酸性氨基酸，4=堿性氨基酸)。數(shù)據(jù)顯示，由于PB1- F2蛋白的斷裂導致構(gòu)成各類氨基酸的比例發(fā)生改變。

表1 2013年H7N9流感毒株P(guān)B1-F2蛋白各類氨基酸比例

毒株類型毒株數(shù)PB1-F2氨基酸長度PB1-F2蛋白各類氨基酸構(gòu)成疏水性氨基酸比例/%親水性氨基酸比例/%酸性氨基酸比例/%堿性氨基酸比例/%完整型PB1-F24690aa25.33±0.9743.52±0.948.92±0.2922.23±0.25截短型PB1-F21752aa27.15±0.9342.31±1.185.43±0.7525.11±0.47

3 討 論

通過對甲型H7N9流感病毒PB1系統(tǒng)進化樹分析可以發(fā)現(xiàn)，系別 Ⅰ、Ⅱ的劃分主要是依據(jù)PB1- F2蛋白斷裂與否。系別 Ⅰ主要是完整型PB1- F2蛋白毒株，除A/chicken/Rizhao/875/2013外。系別Ⅱ主要是截短型PB1- F2蛋白毒株，A/chicken/Shanghai/S1358/2013、A/chicken/Jiangsu/SC099/2013除外。本研究結(jié)果表明，截短型PB1- F2蛋白已經(jīng)成為新型甲型H7N9進化的重要特征。

● 代表人H7N9毒株，◇代表環(huán)境樣本毒株；分支處數(shù)據(jù)是Bootstrap檢驗的可信度；0.005標尺代表單位長度內(nèi)核苷酸差異水平

圖1 2013年期間63株甲型H7N9流感毒株P(guān)B1系統(tǒng)進化樹

方框內(nèi)*為終止密碼子部位，即發(fā)生斷裂部位

圖2 2013年甲型H7N9流感毒株P(guān)B1-F2氨基酸序列特征

PB1- F2基因有40個左右的位置可以通過單個核甘酸的突變提前引入終止密碼子，從而編碼不同長度的C端截短型PB1- F2蛋白[14]。McAuley等[15- 16]采用一系列方法，對來源于不同毒株、完整長度的PB1- F2蛋白的相關(guān)功能分別進行研究，通過反向遺傳方法，將PR8病毒的7個基因片段(PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS)和不同來源的PB1片段[A/Brevig Mission/1/1918(H1N1)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)]分別克隆至pHW2000質(zhì)粒，將每一種PB1片段和PR8病毒的7個基因片段進行重組轉(zhuǎn)化，合成多種來源PB1片段的重組病毒；再對PR8和新病毒進行細胞和小鼠致病性實驗，比較不同毒株P(guān)B1- F2蛋白的促細胞凋亡作用、致小鼠肺部炎癥及小鼠二次肺炎鏈球菌感染的嚴重程度，并監(jiān)測病毒感染細胞時聚合酶活性的變化；又合成既定長度PB1- F2的C端肽鏈(第67至90位aa)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來源于不同毒株的完整PB1- F2蛋白的功能存在一定差異；截短型PB1- F2蛋白仍保留部分功能,如A/Beijing/11/1956(H1N1)，PB1- F2蛋白長度為57aa，截短型PB1- F2蛋白能增加病毒在293T細胞中的聚合酶活性。以上差異同樣被其他相關(guān)研究所證實[17- 19 ]。

在本研究中的63株新型甲型H7N9流感毒株中發(fā)現(xiàn)17株出現(xiàn)斷裂，且均生在PB1- F2的第25位氨基酸后，提示H7N9流感病毒在25位氨基酸后發(fā)生斷裂是比較固定的斷裂位點，而H7N9流感PB1- F2截短型毒株的出現(xiàn)對于H7N9致病性的影響尚需要進一步研究。

已有研究[20]發(fā)現(xiàn)，Brevig Mission(1918年，H1N1)與香港(1997年，H5N1)均有發(fā)現(xiàn)流感毒株中PB1- F2蛋白的第66位堿基發(fā)生點突變，產(chǎn)生氨基酸N66S，并證實其具可提升流感病毒的致病性。本研究中63株新型甲型H7N9流感毒株中第66位均為N，未發(fā)生堿基突變。有研究[21- 22]發(fā)現(xiàn)，H7N9人流感病毒是一個來自于H7N3(A/duck/Zhejiang/12/2011，ZJ12亞型)、H7N9(A/wild bird/Korea/A14/2011，KO14亞型)、H9N2(A/brambling/Beijing/16/2012- like viruses)的禽流感病毒重配株。其中6個內(nèi)部基因(M、NS、NP、PB1、PB2、PA)則來自H9N2。現(xiàn)有關(guān)于H9N2基因進化的研究[14]發(fā)現(xiàn)，H9N2進化中存在66N與N66S毒株，本研究中未發(fā)現(xiàn)N66S毒株，提示在進行新型甲型H7N9的重配過程中，參與重配的H9N2屬于66N毒株。

本研究通過對自2013年2月19日到2013年10月31日所有的甲型H7N9流感病毒毒株P(guān)B1- F2蛋白核酸以及氨基酸序列的分析，發(fā)現(xiàn)在H7N9流感毒株中存在著截短型PB1- F2蛋白毒株，并且H7N9流感病毒毒株P(guān)B1- F2蛋白斷裂位點均在25位氨基酸后，這將成為H7N9流感毒株進化過程中重要的特征。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲型H7N9流感病毒截短型PB1- F2蛋白表現(xiàn)為更加明顯的突變?；谘芯拷Y(jié)果猜想，截短型流感毒株易于導致基因結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，從而使流感毒株易于發(fā)生基因突變，進而利于流感病毒的復制與傳播。這一猜想有待進一步研究和驗證。此外，完整型PB1- F2蛋白與截短型PB1- F2蛋白氨基酸構(gòu)成存在明顯的差異，這種差異對于H7N9流感病毒的致病性機制的影響也有待進一步的研究。

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