文小平，夏海鳴

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，江蘇 南京 210003)

目前認(rèn)為，白介素6(interleukin- 6,IL- 6)與腎上腺皮質(zhì)功能密切相關(guān)，它可以通過下丘腦- 垂體- 腎上腺(Hypothalamic- Pituitary- Adrenal，HPA)軸調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)功能，也可直接作用于腎上腺來影響腎上腺皮質(zhì)功能。此外，腎上腺自身可分泌IL- 6，通過自分泌或旁分泌方式參與腎上腺皮質(zhì)功能的調(diào)節(jié)。但I(xiàn)L- 6對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能的具體影響及調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確。本研究旨在探討IL- 6單獨(dú)及聯(lián)合ACTH處理小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞后皮質(zhì)醇合成水平的變化，以及皮質(zhì)醇合成過程中類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)相關(guān)基因的調(diào)控作用，從而為今后深入了解內(nèi)毒素休克過程中IL- 6對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞系Y1(中科院上海細(xì)胞生物研究所)，IL- 6(Prospec公司)，ACTH(Sigma公司)，F(xiàn)12培養(yǎng)基(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，胎牛血清(GIBCO公司)，臺(tái)盼藍(lán)染液(南京生興生物科技有限公司)，皮質(zhì)醇放免檢測試劑盒(原子高科股份有限公司)，Trizol(美國Invitrogen)，cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Thermo Fisher)，TaqDNA Polymerase(美國Thermo Fisher)，Real time PCR Master Mix(SYBR Green)(日本TOYOBO)，0.1% DEPC水(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，引物由上海英俊公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞系Y1細(xì)胞用含10%的胎牛血清、1.176 g NaHCO3及100 U·L-1青鏈霉素的F12培養(yǎng)液，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 ℃濕飽和的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，以0.25%的混合胰酶消化后按1瓶傳至2～3瓶進(jìn)行傳代，取其對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長期的Y1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105ml-1，接種于6孔板，每孔1 ml，F(xiàn)12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后按照以下分組來添加不同物質(zhì)：(1) 空白對(duì)照組：2 ml F12培養(yǎng)液；(2) IL- 6組：2 ml F12培養(yǎng)液含100 ng·ml-1IL- 6；(3) ACTH組：2 ml F12培養(yǎng)液含10-9mol·l-1ACTH；(4) IL- 6+ACTH組：2 ml F12培養(yǎng)液含100 ng·ml-1IL- 6和10-9mol·l-1ACTH；再按照4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別培養(yǎng)3、6、12、24 h終止實(shí)驗(yàn)。取細(xì)胞上清液于無菌EP中，混勻后以2 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-20 ℃保存。在6孔板中按1∶10加入0.4%的臺(tái)盼藍(lán)，染色2～3 min，在光學(xué)顯微鏡下做活細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果統(tǒng)計(jì)：光鏡下任取5個(gè)視野進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活性=活細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.4 放免法檢測皮質(zhì)醇

從冰箱中取出經(jīng)1.3方法處理的上清液，室溫溶解后通過放免法測定各組細(xì)胞上清中皮質(zhì)醇含量。根據(jù)皮質(zhì)醇放免檢測試劑盒的操作說明，用放免儀測各管沉淀的放射性計(jì)數(shù)(cmp)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出實(shí)驗(yàn)的有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。測得的數(shù)據(jù)中，皮質(zhì)醇以g·ml-1為單位。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測StAR mRNA的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的Y1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105ml-1，接種于6孔板，每孔1 ml。以F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后按照以下分組來添加不同物質(zhì)：(1) 空白對(duì)照組：2 ml F12培養(yǎng)液；(2) IL- 6組：2 ml F12培養(yǎng)液含100 ng·ml-1IL- 6；(3) ACTH組：2 ml F12培養(yǎng)液含10-9mol·l-1ACTH；(4) IL- 6+ACTH組：2 ml F12培養(yǎng)液含100 ng·ml-1IL- 6和10-9mol·l-1ACTH;24 h終止實(shí)驗(yàn)。用Trizol裂解細(xì)胞提取各組總RNA，純化后用DEPC水溶解RNA，并分別在260 nm和280 nm處測其吸光度，計(jì)算出OD260/280值。引物是根據(jù)GenBank收錄的小鼠StAR和GAPDHmRNA序列，由Primer 5軟件設(shè)計(jì)，由上海英俊公司合成，序列見表1。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行操作，得到cDNA。用ABI Step one plus Real time- PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，體系總體積為20 μl：SYBR Green為10 μl，cDNA為 1 μl，引物為2 μl，0.1% DEPC水為7 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸40 s。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，于72 ℃、40 s時(shí)計(jì)算熒光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

Tab1SequencesoftheprimersusedforrealtimeRT-PCR

引物名稱引物序列GAPDHSense primer:5-AAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3Antisense primer:5-AGATGATGACCCTTTTGGCTC-3StARSense primer:5-CTTGGCTGCTCAGTATTGAC-3Antisense primer:5-TGGTGGACAGTCCTTAACAC-3

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活性

見表2。

組 別處理不同時(shí)間后Y1細(xì)胞的活力/×100%3 h6 h12 h24 h空白對(duì)照組60±555±758±560±2IL-6組68±4a70±4a75±3a80±3aACTH組70±10a73±8a79±3a84±5aIL-6+ACTH組75±15a75±10a85±10a90±15a

與空白對(duì)照組比較，aP>0.05

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：IL- 6單獨(dú)或聯(lián)合ACTH處理Y1細(xì)胞不同時(shí)間后，各組的細(xì)胞活力與空白對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著時(shí)間增加，各組細(xì)胞活力雖有明顯增強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 IL- 6單獨(dú)或聯(lián)合ACTH處理Y1細(xì)胞后皮質(zhì)醇的合成量

見圖1。

與空白對(duì)照組比較，aP<0.05

Fig1ThesynthesisofcorticosteroidinY1cellstreatedbyⅠL- 6aloneorcombinedwithACTH

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著IL- 6處理Y1細(xì)胞的時(shí)間增加，皮質(zhì)醇合成量也增加，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(6 h后，P<0.05)；ACTH處理Y1細(xì)胞不同時(shí)間段，隨時(shí)間增加，皮質(zhì)醇合成顯著增加，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3 h后，P<0.05)；IL- 6和ACTH聯(lián)合作用Y1細(xì)胞，隨時(shí)間增加，皮質(zhì)醇合成量進(jìn)一步上升，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3 h后，P<0.05)。

2.3 IL- 6單獨(dú)或聯(lián)合ACTH處理Y1細(xì)胞后StAR mRNA的表達(dá)

見表3。

組 別StAR mRNA△CTFold(2-△△CT)空白對(duì)照組9.83±0.151.00±0.11IL-6組9.10±0.151.67±0.17ACTH組8.90±0.062.06±0.34IL-6+ACTH組8.40±0.352.75±0.61

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：IL- 6、ACTH分別作用于Y1細(xì)胞24 h后，StAR mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，與空白對(duì)照組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IL- 6和ACTH聯(lián)合處理Y1細(xì)胞24 h后，StAR mRNA的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，與空白對(duì)照組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

2000年，Annane等首次提出相對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能不全(relative adrenal cortical dysfunction，RAI)的概念：即處于嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，患者體內(nèi)的皮質(zhì)醇水平代償性升高，但升高程度或者持續(xù)時(shí)間仍不能滿足機(jī)體需要，即為RAI[1]。Dalegrave等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素休克患者并發(fā)RAI的概率達(dá)22%～55%[2]。內(nèi)毒素休克時(shí)RAI發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，但內(nèi)毒素休克時(shí)大量釋放的炎性因子與腎上腺皮質(zhì)功能密切相關(guān)。IL- 6是參與內(nèi)毒素休克的重要炎癥因子之一，對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能的影響值得進(jìn)一步探討。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子與腎上腺皮質(zhì)激素的合成密切相關(guān)：腫瘤壞死因子- α可抑制牛腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞合成皮質(zhì)醇[3]，白介素4可促進(jìn)牛腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞合成皮質(zhì)醇[4]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同濃度(10～200 ng·ml-1)的IL- 6處理從腎口腺皮質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)間(4～24 h)后皮質(zhì)醇合成量開始增加[5]。

本研究前實(shí)驗(yàn)分別用1、10、100 pg·ml-1和1、10、100、200、400 ng·ml-1的IL- 6同時(shí)處理Y1細(xì)胞，12 h后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IL- 6濃度達(dá)1 ng·ml-1后細(xì)胞合成皮質(zhì)醇量增加，100 ng·ml-1皮質(zhì)醇合成量增加達(dá)峰值，超過100 ng·ml-1皮質(zhì)醇合成量開始下降；用100 ng·ml-1IL- 6分別處理Y1細(xì)胞3、6、12、24、48 h，發(fā)現(xiàn)作用6 h后Y1細(xì)胞合成皮質(zhì)醇量增加，24 h達(dá)到峰值，超過24 h后皮質(zhì)醇合成量開始下降；用100 ng·ml-1IL- 6聯(lián)合10-9mol·l-1ACTH處理細(xì)胞3 h后皮質(zhì)醇合成量明顯增加。這些濃度、時(shí)間差異性的產(chǎn)生可能與細(xì)胞種屬、細(xì)胞活性及培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，也可能與實(shí)驗(yàn)試劑的質(zhì)量相關(guān)。

有研究結(jié)果顯示，IL- 6(4.8×10-9mol·L-1)處理腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞48 h后細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活力均無變化[6]。本研究用100 ng·ml-1IL- 6單獨(dú)以及聯(lián)合10-9mol·l-1ACTH共同處理Y1細(xì)胞不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活性與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用100 ng·ml-1的IL- 6及10-9mol·L-1的ACTH，排除IL- 6和(或)ACTH對(duì)Y1細(xì)胞活性的影響。

綜上所述，IL- 6可促進(jìn)Y1細(xì)胞合成皮質(zhì)醇，但其具體機(jī)制仍不明確。2004年，Rainey等[7]研究發(fā)現(xiàn)了腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的皮質(zhì)醇合成通路，即在腎上腺皮質(zhì)以膽固醇為基本“原料”，通過StAR介導(dǎo)，進(jìn)入線粒體內(nèi)膜后經(jīng)過一系列特異性酶催化作用，包括多種形式的細(xì)胞色素P450系列酶和3β羥基固醇脫氫酶(3 beta hydroxy cholesterol dehydrogenase，3β- HSD)，最終合成皮質(zhì)醇。Y1細(xì)胞系是一種研究腎上腺類固醇合成與代謝途徑中多種基因表達(dá)和調(diào)控的較好細(xì)胞模型，其功能與原代腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞相似，受ACTH刺激后，細(xì)胞合成類固醇能力可顯著增加。本研究采用10-9mol·L-1的ACTH刺激Y1細(xì)胞后，皮質(zhì)醇合成量明顯增加，間接證明了Y1細(xì)胞活性良好。

細(xì)胞因子的生物學(xué)功能是通過與靶細(xì)胞膜表面的受體相結(jié)合并將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而發(fā)揮功能。Kontogeogos等應(yīng)用免疫組化和免疫定位方法在人腎上腺皮質(zhì)的束狀帶、網(wǎng)狀帶以及球狀帶區(qū)域檢測到高水平IL- 6和IL- 6受體的表達(dá)[8]。IL- 6可能通過與Y1細(xì)胞表面IL- 6受體結(jié)合成IL- 6/IL- 6R/gp130六聚體蛋白復(fù)合物，激活細(xì)胞內(nèi)的JAK/STAT途徑和Ras/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞合成皮質(zhì)醇[9]。但有研究[6]結(jié)果顯示，IL- 6是通過花生四烯酸代謝途徑調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的類固醇激素分泌功能。

本研究結(jié)果提示，IL- 6聯(lián)合ACTH可明顯促進(jìn)Y1細(xì)胞合成皮質(zhì)醇，分析其原因可能是：(1) ACTH可促進(jìn)離體的牛腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞分泌IL- 6[10]。本研究中ACTH聯(lián)合IL- 6處理Y1細(xì)胞時(shí)可能促進(jìn)Y1細(xì)胞分泌IL- 6或表達(dá)IL- 6R。(2) ACTH通過與腎上腺細(xì)胞表面受體結(jié)合后，在Ca2+調(diào)節(jié)下激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)產(chǎn)生第二信使環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)，進(jìn)一步激活蛋白激酶(Protein Kinase，PKA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響腎上腺細(xì)胞分泌類固醇激素[11]。曾有學(xué)者推測，ACTH與IL- 6之間可能存在關(guān)于cAMP的信號(hào)串?dāng)_，共同促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞合成皮質(zhì)醇。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，IL- 6通過花生四烯酸環(huán)氧酶途徑促進(jìn)ACTH刺激狀態(tài)下的腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞合成皮質(zhì)醇，而非ACTH依賴的cAMP途徑。

細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后啟動(dòng)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)分子間的相互作用，最終引起細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的變化。Koldzic- Zivanovic等通過對(duì)Y1細(xì)胞中StAR以及上游的膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450scc(cholesterol side- chain cleavage enzyme P450scc，CYP11A1)和3β- HSD的檢測發(fā)現(xiàn)，IL- 10通過與ACTH共同作用來抑制上述蛋白的合成[12]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，IL- 6單獨(dú)或聯(lián)合ACTH處理Y1細(xì)胞后，StAR mRNA的表達(dá)水平上升，提示IL- 6可單獨(dú)或聯(lián)合ACTH通過促進(jìn)StAR mRNA表達(dá)增強(qiáng)Y1細(xì)胞合成皮質(zhì)醇的能力。目前，有關(guān)IL- 6對(duì)StAR mRNA表達(dá)的影響機(jī)制尚不明確。影響StAR mRNA表達(dá)的因素主要有cAMP- PKA信號(hào)通路、蛋白激酶C、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、類固醇合成因子- 1、X染色體基因- 1、妊娠特異性β- 1糖蛋白、類固醇誘導(dǎo)蛋白等[13]。在類固醇合成細(xì)胞中，AA從細(xì)胞器釋放是類固醇合成所必需的。許多研究結(jié)果顯示，AA與IL- 6關(guān)系密切，如AA可進(jìn)一步誘導(dǎo)缺氧狀態(tài)下的小鼠胚胎干細(xì)胞分泌IL- 6[14]；IL- 6促進(jìn)體外血小板活化的機(jī)制包括AA誘導(dǎo)途徑[15]等。有報(bào)道，IL- 6通過AA代謝途徑調(diào)節(jié)腎上腺細(xì)胞分泌皮質(zhì)醇激素。研究顯示IL- 6通過抑制磷脂酶A2的活性，使AA代謝受阻，進(jìn)一步使StAR蛋白表達(dá)受到抑制而影響類固醇激素的合成[16]，并且StAR蛋白表達(dá)受阻出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平[17]，有可能是通過降低轉(zhuǎn)錄活性或mRNA的穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)的。因此，推測IL- 6對(duì)StAR mRNA表達(dá)的影響可能通過花生四烯酸脂氧酶代謝途徑進(jìn)行。探討IL- 6與ACTH共同影響StAR表達(dá)機(jī)制的文獻(xiàn)比較少，是否通過促進(jìn)cAMP誘導(dǎo)作用或花生四烯酸代謝途徑以及其他可能的調(diào)節(jié)途徑，這需要進(jìn)一步研究。

近些年來，腎上腺皮質(zhì)功能的損害在內(nèi)毒素休克發(fā)生發(fā)展中的作用已逐漸成為研究熱點(diǎn)。腎上腺皮質(zhì)功能狀態(tài)對(duì)內(nèi)毒素休克的治療和預(yù)后評(píng)估非常重要，而IL- 6是內(nèi)毒素休克發(fā)生過程中重要的細(xì)胞因子。本研究結(jié)果表明，IL- 6與腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞功能密切相關(guān)。因此，深入探討IL- 6對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能的影響及其機(jī)制將為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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