王 藝 陳金石 李隆玉 李 凌

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其中宮頸鱗癌約占80%～90%。雖然目前對(duì)于宮頸鱗癌的治療效果取得了顯著進(jìn)步，但晚期及復(fù)發(fā)性宮頸鱗癌患者治療效果及預(yù)后卻不夠理想。隨著惡性腫瘤多學(xué)科綜合治療模式的轉(zhuǎn)變，基因治療倍受矚目。因此，探索宮頸鱗癌基因治療具有重大意義。本研究將hTERT SiRNA導(dǎo)入耐藥宮頸鱗癌SiHa/DDP細(xì)胞株后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)hTERT mRNA含量、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，并將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸鱗癌耐藥細(xì)胞株SiHa/DDP：由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院遺傳實(shí)驗(yàn)室劉珊玲教授惠贈(zèng)。hTERT SiRNA由Invitrogen公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和合成 目的基因hTERT及內(nèi)參照基因的PCR引物采用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件，并經(jīng)GeneBank Blast進(jìn)行同源性比較，確定其特異性，引物序列：hTERT上游引物，5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；下游引物，5’-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’；GAPDH上游引物，5’-CGTGGTTTCTGTGTGGTGTC-3’；下游引物，5’-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’。由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組(A組)，脂質(zhì)體對(duì)照組(B組)，Negative Control siRNA對(duì)照組(C組)，轉(zhuǎn)染組(D組)[hTERT SiRNA與脂質(zhì)體混合液轉(zhuǎn)染SiHa/DDP細(xì)胞組(熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞hTERT mRNA實(shí)驗(yàn)時(shí)，該組有SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3小組)]。不同時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，重復(fù)3次，每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)設(shè)置3復(fù)孔。

1.2.3 SiHa/DDP細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)瓶含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每毫升加2微克順鉑的混合液，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 設(shè)計(jì)并化學(xué)合成hTERT siRNA 根據(jù)Genebank中的hTERT基因序列，遵守siRNA設(shè)計(jì)原則并參考相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了三對(duì)長(zhǎng)度均為21bp的siRNA鏈，并由美國(guó)Invitrogen公司上海分部協(xié)助合成，Negative Control siRNA正義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’；反義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’。SiRNA-1正義鏈，5’-GGAGCAAGUUGCAAAGCAUTT-3’；反義鏈，5’-AUGCUUUGCAACUUGCUCCTT-3’。SiRNA-2正義鏈，5’-GGAACACCAAGAAGUUCAUTT-3’；反義鏈，5’-AUGAACUUCUUGGUGUUCCTT-3’。SiRNA-3正義鏈，5’-GCACCAACAUCUACAAGAUTT-3’；反義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’。序列經(jīng)檢索證實(shí)與其它基因無(wú)同源性，siRNA帶有綠色熒光蛋白作標(biāo)記。

1.2.5 hTERT SiRNA轉(zhuǎn)染SiHa/DDP細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)步驟如下：①種板：轉(zhuǎn)染前一天，以(4～6)×105/孔的密度將細(xì)胞轉(zhuǎn)種到6孔板中，加入1 ml無(wú)抗生素培養(yǎng)基，并保證轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度為70%～85%。② hTERT siRNA和脂質(zhì)體的配置：依照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，轉(zhuǎn)染當(dāng)天用EP管把干粉裝10 OD siRNA離心→加300 μlDEPC水(獲得10 μM濃度siRNA300 μl，此時(shí)10 μlsiRNA溶液含siRNA100 pmol)→加120 μl ployfectine轉(zhuǎn)染試劑輕輕搖晃混勻，室溫靜置15 min。③孵育siRNA脂質(zhì)體溶液同時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞3次，然后于每孔中加入1.0 ml無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。siRNA脂質(zhì)體溶液孵育15 min后，轉(zhuǎn)移至6孔板中，輕輕搖動(dòng)，置培養(yǎng)箱孵育5 h后更換完全培養(yǎng)基。24 h后取出6孔板，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白估計(jì)轉(zhuǎn)染效率，選擇熒光監(jiān)測(cè)效果明顯的處理孔完成后面實(shí)驗(yàn)。

1.3 hTERT mRNA含量檢測(cè)

試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程：總RNA的提取，然后去除基因組DNA，再行逆轉(zhuǎn)錄，然后采用Real-time PCR檢測(cè)hTERT mRNA含量，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了三對(duì)長(zhǎng)度均為21bp的siRNA鏈 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組hTERT mRNA表達(dá)，然后選取對(duì)hTERT mRNA表達(dá)抑制效果最明顯的siRNA鏈(siRNA-1)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞分散于200 ml的PBS緩沖液中，用4 ℃預(yù)冷的PBS分別洗滌待檢測(cè)細(xì)胞兩次，用吸管吸盡PBS。加入2 ml預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定細(xì)胞抗原；250 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移懸液至EP管，用100 μL Binding Buffer充分潤(rùn)洗六孔板殘留細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管，往EP管加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL 20 μg/mL的PI，混勻后避光，室溫反應(yīng)20 min，加PBS400 μL稀釋細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為(5～6)×105/ml，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，通過(guò)軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 MTT法檢測(cè)hTERT SiRNA轉(zhuǎn)染后SiHa/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制變化

選取貼壁80%～90%的六孔板，消化。各處理組細(xì)胞懸液分別以100 μL接種于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔；同時(shí)設(shè)調(diào)零孔和細(xì)胞對(duì)照孔。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱。于24 h、48 h、72 h 3個(gè)時(shí)間，于每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，于每孔中加入200 μL DMSO終止反應(yīng)。室溫下置于搖床振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。應(yīng)用作圖軟件OD值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)抑制曲線,觀測(cè)hTERT siRNA對(duì)宮頸癌耐藥細(xì)胞株SiHa/DDP的生長(zhǎng)抑制效果。

1.6 結(jié)果判定

轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后提取各處理組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行定量分析，由系統(tǒng)自動(dòng)記錄熒光曲線并分析計(jì)算出Ct值。計(jì)算方式：△Ct=Ct(hTERT)-Ct(hGAPDH)，△△Ct =(樣品Ct值-內(nèi)參照Ct值)-(對(duì)照組樣品Ct值-對(duì)照組內(nèi)參照Ct值)，然后取2-△△Ct代表被檢樣品初始hTERT mRNA含量。MTT設(shè)置酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞OD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 觀察熒光細(xì)胞

熒光顯微鏡下觀察，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無(wú)熒光，而轉(zhuǎn)染的SiHa/DDP細(xì)胞可見(jiàn)有綠色熒光。

2.2 轉(zhuǎn)染后hTERT mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

2.2.1 不同siRNA對(duì)SiHa/DDP細(xì)胞hTERT表達(dá)水平的抑制作用 hTERT siRNA轉(zhuǎn)染SiHa/DDP細(xì)胞24 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞hTERT mRNA，結(jié)果siRNA-1、siRNA-2和SiRNA-3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的hTERT mRNA表達(dá)量均顯著下降:設(shè)定空白對(duì)照組為1，其各組細(xì)胞hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量(即拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值)均值分別為：SiRNA-1組(0.249±0.019)、SiRNA-2組(0.273±0.028)、SiRNA-3組(0.350±0.017)、Negative Control siRNA組(0.931±0.036)、脂質(zhì)體對(duì)照組(0.956±0.052)(圖1)。單因素方差分析結(jié)果顯示：SiRNA-1組、SiRNA-2組、SiRNA-3組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別與Negative Control siRNA組、脂質(zhì)體組及空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SiRNA-1組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量與SiRNA-2組、SiRNA-3組相互比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Negative Control siRNA組、脂質(zhì)體對(duì)照組及空白對(duì)照組相互比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？梢?jiàn)SiRNA-1組、SiRNA-2組、SiRNA-3組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量較各未轉(zhuǎn)染對(duì)照組均明顯下降，說(shuō)明3個(gè)構(gòu)建的SiRNA片段均有良好抑制效果，三組片段間無(wú)明顯差異，選取對(duì)hTERT mRNA表達(dá)抑制效果最強(qiáng)的siRNA-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 轉(zhuǎn)染24 h后轉(zhuǎn)染組及各對(duì)照組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2.2 siRNA-1對(duì)SiHa/DDP細(xì)胞hTERT表達(dá)水平的抑制作用 轉(zhuǎn)染48 h及72 h后繼續(xù)檢測(cè)siRNA-1轉(zhuǎn)染組、Negative Control siRNA組、脂質(zhì)體組及空白對(duì)照組hTERT mRNA含量。同理用2-△△Ct公式計(jì)算被檢樣品hTERT mRNA含量，其他各組細(xì)胞hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量均值與空白對(duì)照組比較，48 h分別為：siRNA-1組(0.138±0.009)，Negative Control siRNA組(0.940±0.025)，脂質(zhì)體組(0.961±0.037)，siRNA-1組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量與各對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。72 h分別為：siRNA-1組(0.174±0.016)，Negative Control siRNA組(0.901±0.042)，脂質(zhì)體組(0.943±0.28)；siRNA-1組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量與各對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。可見(jiàn)siRNA-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的hTERT mRNA表達(dá)量下降顯著，見(jiàn)圖2。

圖2 siRNA-1組及對(duì)照組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。轉(zhuǎn)染24 h后hTRET siRNA轉(zhuǎn)染組凋亡率為(75.83±2.18)%,與A組[(0.18±0.07)%]比較有顯著差異，而轉(zhuǎn)染48 h時(shí)轉(zhuǎn)染組凋亡率增高至(86.48±7.18)%，轉(zhuǎn)染72 h凋亡率較48 h下降(83.41±5.81)%。比較轉(zhuǎn)染24 h各組早期細(xì)胞凋亡率：siRNA-1組[(75.83±2.18)%]明顯高于C組[(2.11±0.08)%]、B組[(0.32±1.22)%]和A組[(0.18±0.07)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；hTRET siRNA轉(zhuǎn)染組壞死細(xì)胞和晚期細(xì)胞凋亡率[(18.02±2.71)%]同樣明顯高于C組[(2.03±0.10)%]、B組[(0.36±1.02)%]和A組[(0.08±0.02)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 MTT法檢測(cè)hTERT SiRNA轉(zhuǎn)染后SiHa/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后分別采用MTT比色法檢測(cè)各組SiHa/DDP細(xì)胞OD490均值：siRNA-1組分別為(0.103±0.006)、(0.080±0.004)、(0.032±0.0006)；空白細(xì)胞對(duì)照組分別為(0.118±0.008)、(0.151±0.005)、(0.190±0.003)；脂質(zhì)體對(duì)照組分別為(0.111±0.006)、(0.143±0.003)、(0.179±0.001)，Negative Control siRNA對(duì)照組分別為(0.110±0.004)、(0.127±0.004)、(0.168±0.005)；同一時(shí)間點(diǎn)各組OD490均值單因素方差分析比較，siRNA-1組明顯低于其余3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以O(shè)D490均值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖3。

3 討論

端粒酶是1種RNA蛋白復(fù)合體，由三個(gè)部分組成：端粒酶自身RNA模板、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TRET)、端粒酶相關(guān)蛋白，其以自身的RNA為模板合成端粒重復(fù)序列使端粒長(zhǎng)度得以維持[1]，而人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,hTERT)是其活性表達(dá)的關(guān)鍵組份和限速因子[2]。端粒的主要功能是在染色體末端形成帽子結(jié)構(gòu)，使染色體不會(huì)隨著復(fù)制后RNA引物的降解而縮短，也使染色體末端無(wú)有害融合，從而維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性。Zheng等[3]研究發(fā)現(xiàn)宮頸病變時(shí)端粒酶被激活，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)時(shí)即可檢測(cè)到端粒酶的表達(dá),而宮頸癌時(shí)激活程度更高,發(fā)現(xiàn)端粒酶激活概率隨宮頸癌病變進(jìn)展而升高，并認(rèn)為TERC基因擴(kuò)增檢測(cè)可以提供一個(gè)有效的非侵入性的方法用來(lái)評(píng)估鑒別宮頸疾病病變級(jí)別高低。Jin等[4]采用液基薄層原位雜交(FISH)細(xì)胞病理學(xué)檢查和檢測(cè)擴(kuò)增的熒光在130多名婦女進(jìn)行人類乳頭狀瘤病毒DNA 檢測(cè)、陰道鏡活檢和組織病理學(xué)檢查。結(jié)果人類乳頭狀瘤病毒DNA 檢測(cè)、陰道鏡活檢和組織病理學(xué)檢查均顯示在宮頸高度鱗狀上皮病變患者中hTERC基因擴(kuò)增率高于宮頸高度鱗狀上皮病變患者。并認(rèn)為FISH檢測(cè)hTERC基因擴(kuò)增可能是區(qū)分低級(jí)別和高級(jí)別的宮頸鱗狀細(xì)胞疾病的診斷的一種有效的輔助細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)檢查。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在宮頸癌組織中hTERT mRNA高表達(dá)與端粒酶激活關(guān)系密切，對(duì)宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)或hTERT mRNA異常高水平表達(dá)，既可當(dāng)作早期診斷宮頸癌的一個(gè)標(biāo)志，還可以輔助判斷宮頸病變級(jí)別高低。

圖3 hTRET SiRNA-1對(duì)SiHa/DDP細(xì)胞體外增殖的抑制作用

我們先期有相關(guān)研究[5]針對(duì)江西省2499例30～49歲農(nóng)村婦女進(jìn)行了以病理為金標(biāo)準(zhǔn)的宮頸癌篩查發(fā)現(xiàn)在CINⅡ及以上病變hTERC基因擴(kuò)增明顯；且隨著宮頸病變程度的增加,hTERC基因表達(dá)率增加。由此可見(jiàn)，hTERC基因異常的染色體不穩(wěn)定性與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系密切?？梢?jiàn)hTERT與宮頸癌密切關(guān)系，但通過(guò)hTERT SiRNA手段對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞凋亡實(shí)際效果的細(xì)胞及分子水平的研究報(bào)道較少。hTERT作為端粒酶的關(guān)鍵組分維持端粒長(zhǎng)度，能直接參與腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的調(diào)控，它的表達(dá)受多個(gè)水平多個(gè)因子精密調(diào)控，與宮頸鱗癌的臨床病理指標(biāo)具有相關(guān)性，是宮頸癌基因干擾實(shí)驗(yàn)的良好靶基因。通過(guò)有效siRNA片段抑制hTERT表達(dá)能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖并促進(jìn)凋亡，至于siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞后作用場(chǎng)所這點(diǎn)目前尚無(wú)定論，有研究支持是在細(xì)胞核內(nèi)作用[6]，有研究認(rèn)為其限于在細(xì)胞漿作用[7]，具體明確還待進(jìn)一步研究。

靶向RNA干擾對(duì)腫瘤的端粒酶的抑制作用是一個(gè)多階段、多因素的復(fù)雜過(guò)程，目前端粒酶分子機(jī)制尚未被完全明確。此外，端粒的延長(zhǎng)也還存在著不依靠端粒端粒酶活性的方式。因此可以推測(cè)不可能所有類型的腫瘤對(duì)端粒酶抑制劑產(chǎn)生良好的抑制反應(yīng)。而且在細(xì)胞周期的不同階段的端粒酶活性各不相同，如何在不同的階段的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有針對(duì)性的抗端粒酶治療，這也仍然是一個(gè)問(wèn)題。已有的靶向治療端粒酶研究多針對(duì)體外各種細(xì)胞系的，動(dòng)物模型研究相對(duì)缺乏，因此建立合適的動(dòng)物模型進(jìn)行研究是一個(gè)迫切的問(wèn)題。目前的RNAi靶向端粒酶大部分主要是抑制端粒酶的單個(gè)組件，因此這不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)，隨后的RNA干擾技術(shù)的研究應(yīng)該考慮利用同一基因家族的多個(gè)基因有的同源片段，因?yàn)榇似斡懈叨缺Ｊ氐奶匦?，所以如果成功設(shè)計(jì)出有效的同源序列的siRNA分子片段，則有可能實(shí)現(xiàn)在同一時(shí)間較強(qiáng)效果地除去各期端粒酶活性。即便如此，RNA干擾技術(shù)在腫瘤基因靶向治療完全抑制端粒酶活性的實(shí)際臨床應(yīng)用仍然有很多目前尚未解決的難題。雖然目前有多種siRNA的體內(nèi)遞送方法，但它們應(yīng)用于人體臨床治療的安全性仍然是一個(gè)重大的問(wèn)題。

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