胃腺癌中ROS1基因重排及其臨床意義

魏亞寧 王婭南 賈友超 譚莉莉 臧愛民

胃癌是嚴重威脅人類健康的主要惡性腫瘤,胃腺癌是胃癌中最常見的組織學類型，因此在研究胃癌發(fā)病機制中備受關注。近年來認為RTK染色體重排存在于常見的多種惡性腫瘤中，ROS1屬于Ⅱ類受體酪氨酸激酶(RTK)的胰島素受體家族,在對進展期胃癌治療靶點的探索研究中發(fā)現(xiàn)原癌基因1(ROS1基因)，針對ROS1基因重排的進一步研究終將為胃腺癌個體化治療鋪就藍圖，基于此,我們對胃腺癌中ROS1基因重排的發(fā)生頻度進行研究，分析ROS1基因重排及其臨床意義，探討ROS1與胃腺癌的關系，進一步闡釋ROS1基因重排在胃腺癌人群中發(fā)生的生物學意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集自2010年7月到2013年6月期間我院收治的、經(jīng)手術病理檢查證實的60例胃腺癌患者，術前均未經(jīng)放療和化療，其中男性患者32例，女性患者28例，平均年齡(54.5±7.8)歲。高分化腺癌14例,中分化腺癌33例,低分化腺癌13例。淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移42例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例,癌旁組織取自距腫瘤基底部至少5 cm外的黏膜組織。

1.2 試劑及細胞株

ROS1分離探針、兔抗人ROS1、兔抗人TNF-α、兔抗人IL-6多克隆抗體購自美國LLK公司，DMEM 培養(yǎng)基和 0.25% 胰蛋白酶購自美國Abcam公司;胎牛血清購自美國Gibcol公司;MTS 購自美國Promega公司，組織芯片手動制作儀購自美國Beecher Instruments 公司，熒光顯微鏡購自德國 Carl Zeiss 公司。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片( TMA ) 的構(gòu)建 經(jīng)兩名病理醫(yī)生閱片并選取有代表性的腫瘤區(qū)域，運用組織芯片手動制作儀(美國Beecher Instruments 公司)制作TMA。每例取兩點，共制備3個TMA。

1.3.2 熒光原位雜交 將石蠟切片脫蠟，水化，漂洗，晾干待用。取10 μL探針混合液73 ℃變性 5 min，覆蓋待用組織上并加蓋玻片，橡膠膠水封片。采用熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞的FISH信號。ROS1分離探針混合液所使用的細菌人工染色體克隆包括FIG-ROS1、CD74-ROS1、SCL34A2-ROS1、TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、LRIG-ROS1、EZR-ROS1和KDELR2-ROS1。

1.3.3 免疫組化染色 對于 TMA 上組織孔缺失或無腫瘤組織的病例，選取代表性腫瘤組織切片，行ROS1、TNF-α、IL-6免疫組化染色。將石蠟切片脫蠟修復后，滴加第一抗體(ROS1、TNF-α、IL-6抗體，均為1∶100稀釋)，加入辣根過氧化物酶標記的第二抗體孵育，顯色并以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果判定:其著色深度等級分為四級(無著色為0分、著色淺為1分、著色中等為2分、著色深為3分)；著色范圍等級分為五級(0～1%為0分、2%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75% 為3分、>75%為4分)，兩者評分的乘積在0～4分之間判定為陰性和弱陽性，4分以上判定為強陽性。 熒光原位雜交結(jié)果判定:ROS1未發(fā)生重排使用ROS1分離探針可檢測出兩對共定位綠色和紅色信號。ROS1發(fā)生重排時出現(xiàn)兩個共定位信號之一的分離或缺失。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 ROS1表達與胃腺癌臨床病理學指標的關系

在胃腺癌組織中ROS1陽性表達率為53.3%(32/60)，其中發(fā)現(xiàn)SCL34A2-ROS1基因重排發(fā)生頻率為1.7%(1/60),未檢測到FIG-ROS1、CD74-ROS1、TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、LRIG-ROS1、EZR-ROS1和KDELR 2-ROS1基因重排陽性患者。ROS1蛋白過表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、發(fā)生部位、腫瘤直徑、Laurén分類、病理分級、HP 感染、浸潤深度和TNM 分期等無關，見表1。

表1 ROS1蛋白表達與胃腺癌臨床病理學指標的關系/例

2.2 ROS1表達與胃腺癌預后的關系

60例患者隨訪8～44個月，中位時間為24個月。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，ROS1過表達患者總體生存率低于ROS1陰性及弱表達患者(P<0.05)，見圖1。

2.3 胃腺癌中TNF-α、IL-6蛋白表達與ROS1基因重排的關系

在胃腺癌ROS1蛋白陽性者中TNF-α、IL-6蛋白陽性表達率明顯高于ROS1蛋白表達陰性及弱陽性者，ROS1基因重排與TNF-α、IL-6蛋白過表達呈正相關，具有統(tǒng)計學意義，P<0.05，見表2。

圖1 ROS1蛋白表達與胃腺癌患者總體生存率的關系

表2 TNF-A和IL-6 蛋白表達與ROS1表達的相關性(例，%)

3 討論

迄今為止，在多種癌癥中已發(fā)現(xiàn)多種不同的ROS1融合基因，盡管ROS1受體酪氨酸激酶的正常功能尚未確，但ROS1異位表達以及ROS1激酶的變異活化見于諸多腫瘤[1]。近年針對ROS1受體的研究認為ROS1受體酪氨酸激酶參與激活多條下游信號轉(zhuǎn)導通路，包括RAS-MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3以及PLCγ/IP3和SHP2/VAV3途徑。傳統(tǒng)的研究已發(fā)現(xiàn)RAS-MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3與腫瘤細胞增殖有密切關系[2-7]。故本研究采用 FISH 的方法，首次系統(tǒng)檢測ROS1基因重排在我國胃腺癌人群中發(fā)生的頻度和臨床病理特征。

ROS1基因在進化上相對保守，屬于II類RTK的胰島素受體家族，位于第6號染色體q21區(qū)，全長cDNA包含44個外顯子，編碼2347個氨基酸，分子量為259 kDa[8-10]。自1982年發(fā)現(xiàn)至今認為其具有獨特致癌作用的基因，研究顯示ROS1基因重排可能與癌癥的發(fā)病有關系[11]，隨著越來多的ROS1基因重排組合被發(fā)現(xiàn)，為進一步了解癌癥患者的病情變化及個體化療效果差異有著重要的意義，復發(fā)與轉(zhuǎn)移是胃腺癌患者的主要死亡原因，針對不同的基因重排使用不同有針對性的治療方案成為個體化治療的最終夢想。

本研究中胃腺癌患者中ROS1基因融合發(fā)生率為1.7%(1/60)。但依據(jù)我國關于肺癌中的ROS1基因融合發(fā)生率約為1%～2%，與本文發(fā)生率一致，遠遠低于EGFR突變和 ALK重排變異，此數(shù)據(jù)也從另一方面證實ROS1基因相對保守[12]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)ROS1的過表達和腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關，提示ROS1基因可能在胃腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。但ROS1基因通過何種途徑調(diào)控信號轉(zhuǎn)導尚不清楚，本研究通過在ROS1過表達的胃腺癌患者與ROS1陰性表達的胃腺癌患者的生存預后的比較，發(fā)現(xiàn)ROS1過表達者生存率低，認為ROS1的過表達在我國胃腺癌人群中是一個預后不良因子。

TNF-α、IL-6是由單核/巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子，在多種腫瘤研究中認為TNF-α、IL-6蛋白過表達與腫瘤的惡性程度相關，高表達預示著遠處轉(zhuǎn)移及預后差[13]。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6蛋白在在胃腺癌患者ROS1蛋白陽性者中陽性表達率明顯高于患者ROS1蛋白陰性及弱陽性者，ROS1基因重排與TNF-α、IL-6蛋白過表達呈正相關。ROS1基因重排與TNF-α、IL-6蛋白高表達亦可能發(fā)揮協(xié)同作用，促使胃腺癌疾病的發(fā)生、發(fā)展?？茖W家發(fā)現(xiàn)ROS1重排陽性者對厄洛替尼治療無效，改用克唑替尼治療，可在短時期內(nèi)改善患者的不適癥狀，患者繼續(xù)用藥6個月無復發(fā)跡象。這表明，克唑替尼對ROS1重排陽性NSCLC患者有明顯治療效果，ROS1重排陽性腫瘤患者是否對克唑替尼治療更加敏感仍需要大樣本、更多臨床研究單位參與和證實[14-15]。像本研究一樣，本研究標本量少，僅僅發(fā)現(xiàn)1例SCL34A2-ROS1基因重排，故仍未發(fā)現(xiàn)兩者之間的相關性及其機制。

綜上所述，ROS1基因主要影響胃腺癌的發(fā)病風險性，而與胃腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的相關性，并發(fā)現(xiàn)ROS1基因重排與TNF-A、IL-6表達呈一定的關聯(lián)性。因此，ROS1基因重排的檢測可能對患者的治療及預后的判定提供參考。但由于時間緊迫，本實驗所收集的病例組例數(shù)較少，未能更全面的分析其綜合重組率及其與其他臨床資料的線性關系比較。

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