羅慶豐 李金高 張小芳 付愛榮 齊淑軼 黃先明 張 科

鼻咽癌是常見多發(fā)的惡性腫瘤,放化療綜合治療是近期主要的治療方式,失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)，我們通過研究鼻咽癌的患者腫瘤局部的免疫狀態(tài)，探索腫瘤復(fù)發(fā)機(jī)制，預(yù)測腫瘤的預(yù)后因子，降低復(fù)發(fā)的發(fā)生率，提高患者的生存質(zhì)量和生存時間，改善治療效果，為鼻咽癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2006年3月-2007年5月收集98例在江西省腫瘤醫(yī)院院治療的鼻咽癌患者，其中男性54例，女性44例，年齡27～70歲，中位年齡56歲；患者均經(jīng)病理檢查證實為鼻咽非角化癌，收集患者5年隨訪資料。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 試劑 CXCL12蛋白單克隆抗體(即用型)及MaxvisionTM免疫組化試劑盒購自英國Abcam公司，CXCL12蛋白為工作液，參考滴度1∶100。

1.2.2 方法 CXCL12蛋白標(biāo)記檢測采用MaxvisionTM免疫組化法，操作按說明書進(jìn)行：① 4 μm連續(xù)切片，裱于涂有APES的載玻片上，70 ℃烤片2 h;② 二甲苯脫蠟，梯度酒精入水；③ 3%過氧化氫室溫孵育30 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；④ 抗原修復(fù)：切片浸于pH 6.0檸檬酸溶液中，電飯鍋中煮沸5 min，保溫10 min，自然冷卻；⑤ PBS洗,3 min×2次；⑥ 加入CXCL12抗體，4 ℃冰箱12 h；⑦ 復(fù)溫，PBS洗去一抗3 min×2次；⑧ 滴加Maxvision試劑，室溫作用1 h；⑨ PBS洗3 min×2次；⑩ DAB光鏡下顯色，蘇木精復(fù)染，封片。光鏡下觀察CXCL12蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)。陽性對照：購自英國Abcam公司CXCL12蛋白乳腺癌陽性組織片。陰性對照：PBS代替一抗。

1.2.3 結(jié)果判斷 細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色顆粒沉著者為CXCL12蛋白陽性表達(dá)。選擇CXCL12蛋白陽性表達(dá)熱點區(qū)的4個高倍視野，記數(shù)400個以上細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量，根據(jù)著色強(qiáng)度及顯色癌細(xì)胞比例將染色結(jié)果分為-、+、++和+++。染色強(qiáng)度評分方法為：無著色計0分；染色為淺棕色計1分;染色為棕色計2分;染色為棕褐色計3分。陽性細(xì)胞百分比:無陽性細(xì)胞計0分;陽性細(xì)胞數(shù)<10%計1分;10%～<50%計2分;50%～<75%計3分;≥75%計4分。由兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片完成,核對結(jié)果,取得共識。上述兩項結(jié)果之乘積為最后評分結(jié)果，結(jié)果分為：①陰性表達(dá)，<4分為(-);②陽性表達(dá)，≥4～<6分為(+),≥6～<9分為(++),9≥～<12分為(+++)。

1.3 治療方法

按國際抗癌聯(lián)盟 UICC 2003 版鼻咽癌分期標(biāo)準(zhǔn)對患者進(jìn)行臨床TNM分期，根據(jù)分期結(jié)果確定治療方案。放射源為直線加速器治療機(jī)，采用常規(guī)分割方法。98例均完成同期化療和放射治療，放療劑量為鼻咽部66～72 Gy/33～36次/7～8周，頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)60～70 Gy/30～35次/7～8周，頸部的預(yù)防照射劑量46～50 Gy/23～25次/5～6周。同期采用PF方案化療：順氯氨鉑20 mg/m2和5-氟尿嘧啶500 mg/m2，靜脈滴注，連用5天。

1.4 療效評價方法

應(yīng)用WHO實體瘤近期療效評定標(biāo)準(zhǔn)，放療結(jié)束時根據(jù)CT檢查結(jié)果評價即時療效，分為CR和PR。

1.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析， 生存率采用Kaplan-Meier分析。

2 結(jié)果

2.1 CXCL12蛋白表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

CXCL12蛋白表達(dá)與鼻咽癌病理組織亞型無相關(guān)性，CXCL12蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CXCL12陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；CXCL12蛋白表達(dá)與鼻咽癌TNM及治療療效顯著相關(guān)(P均<0.05)，見表1。

表1 CXCL12蛋白表達(dá)與鼻咽癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

2.2 CXCL12蛋白陽性表達(dá)與鼻咽癌患者5年生存率的關(guān)系

CXCL12蛋白陰性者5年生存率為68.8%，CXCL12蛋白陽性者5年生存率為43.9%，兩者比較具有顯著性差異(log-rank，χ2=6.07，P=0.01，P<0.05)，見圖1。

3 討論

鼻咽癌是常見多發(fā)的惡性腫瘤,大多數(shù)患者確診時為中晚期，轉(zhuǎn)移與浸潤是鼻咽癌的治療與預(yù)后主要因素，我們通過研究鼻咽癌患者腫瘤局部的微環(huán)境狀態(tài)，檢測鼻咽癌中趨化因子(CXCL12)表達(dá)狀態(tài)，預(yù)測腫瘤的治療和預(yù)后因素，探索鼻咽癌復(fù)發(fā)機(jī)制。

趨化因子(CXCL12)是一類最早被發(fā)現(xiàn)控制免疫細(xì)胞向炎癥定向遷移的細(xì)胞因子,其功能由相應(yīng)受體介導(dǎo),與高遷移率族蛋白1(HMGB1)結(jié)合后可產(chǎn)生誘

圖1 CXCL12蛋白陽性表達(dá)與鼻咽癌患者5年生存率的關(guān)系

導(dǎo)靶細(xì)胞趨化性遷移等多種生理功能[1]。趨化因子及其受體在多種腫瘤細(xì)胞呈高表達(dá),與惡性腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

CXCLl2基因位于10號染色體長臂，是高度保守的G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體。在胚胎的發(fā)育、干細(xì)胞的遷移和各種免疫反應(yīng)中起重要作用，是許多生理和病理過程中指導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動的中心因素，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖[2-3]。CXCLl2和相應(yīng)受體CXCR構(gòu)成的生物學(xué)軸在多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，趨化因子能通過刺激腫瘤細(xì)胞生長，趨化腫瘤細(xì)胞以及促進(jìn)血管生長和消化細(xì)胞外基質(zhì)的間接作用促進(jìn)腫瘤的的生長和轉(zhuǎn)移[4]。腫瘤細(xì)胞的遷移是由其所表達(dá)的趨化因子受體和靶器官表達(dá)的趨化因子所決定，與腫瘤的新生血管的形成有關(guān)，而CXCLl2和CXCR結(jié)合物在惡性腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移過程中，主要是促進(jìn)腫瘤血管的形成，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長增殖，Salvucci等[5]研究表明閉血管內(nèi)皮生長因子及堿性成纖維細(xì)胞通過抗CXCLl2-CXCR4抗體阻斷CXCLl2-CXCR4的功能或iRNA技術(shù)使得CXCLl2-CXCR4基因沉默，可抑制血管生長因子依賴的血管生成，從而抑制腫瘤的生長。

本研究中CXCLl2陽性表達(dá)患者轉(zhuǎn)移率高于陰性表達(dá)患者，且與臨床分期密切相關(guān)提示CXCLl2的表達(dá)增高與鼻咽癌生長增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。該研究結(jié)果與Lshigami等[6]和Yasumoto等[7]關(guān)于胃癌的研究結(jié)果一致，CXCL12作為1種與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因子，可為鼻咽癌的腫瘤預(yù)后標(biāo)記物之一。CXCLl2陽性表達(dá)患者5年生存率明顯低于陰性表達(dá)者，因此根據(jù)患者腫瘤組織CXCLl2表達(dá)情況，給與個體化的綜合放化療輔助治療，提高患者的生存率。

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