王曉英 屈昌民 梁淑文 李連勇 宮淑娟 翟靜妤 王寶艷

結(jié)腸癌(colon cancer)是消化系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升的趨勢(shì)。尋找結(jié)腸癌浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，尋找關(guān)鍵標(biāo)記，對(duì)早期診斷、靶向干預(yù)治療和預(yù)后判斷有非常重要的意義。有大量報(bào)道表明[1]，LIM激酶(LIM kinase,LIMK)在胃癌、前列腺癌和肝癌等惡性腫瘤組織中均有高度表達(dá)，但尚無(wú)明確的結(jié)腸癌研究報(bào)告。我們通過(guò)自制組織芯片技術(shù)檢測(cè)LIMK1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，從而研究其臨床病理價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2010-2013年本院行外科手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織68例、上皮內(nèi)瘤變17例以及遠(yuǎn)離結(jié)腸癌的正常組織標(biāo)本31例，合計(jì)116例。全部患者術(shù)前都行HE病理組織活檢得到確診，且尚未接受放、化療治療。結(jié)腸癌患者中男性43例，女性25例，≥65歲者42例，<65歲者26例；低分化腺癌21例，中分化腺癌43例，高分化腺癌4例；TNM分期：Ⅲ期及以上者37例，Ⅰ+Ⅱ期31例；腫塊直徑<3 cm者24例，≥3 cm者44例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。

1.2 組織芯片制作

依據(jù)HE病理組織切片確定有代表價(jià)值的典型病變部位，自制組織芯片。采用Beecher Instruments生產(chǎn)的組織芯片儀和2 mm組織穿刺針?；玖鞒檀笾氯缦拢孩僦苽浣M織芯片模塊：將蜂蠟和萊卡石蠟以7∶3的比例混合起來(lái)，制備成2.2 cm×3.5 cm×1.0 cm的蠟塊，同時(shí)設(shè)計(jì)5×10點(diǎn)組織列陣，并通過(guò)芯片儀打孔做成帶孔的空白蠟塊。②制備組織芯片：在40～41 ℃水浴中軟化蠟塊2 min，選取病變部位，逐步拿出2 mm×3 mm的組織柱，并相繼推入預(yù)先設(shè)計(jì)的空白蠟塊孔內(nèi)，排列成組織芯片，并將組織芯片面朝下置于玻片上，在37 ℃恒溫中靜置半小時(shí)，輕輕按壓玻片使得組織柱能夠在模塊中排列平整。

1.3 免疫組化染色

使用美國(guó)ABZOOM公司生產(chǎn)的LIMK1單克隆抗體(ab55414)，SP通用試劑盒、0.1 mol/L(pH6.0)PBS、0.01 mol/L(pH6.0)檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、DAB酶底物顯色試劑盒和EDTA修復(fù)液均購(gòu)自福州邁新公司，主要的操作流程則依據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

LIMK1陽(yáng)性表達(dá)定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，并且呈現(xiàn)棕黃或者棕褐色。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色程度和染色細(xì)胞的百分比量化計(jì)分：深棕色為2分，淺棕色為1分，未著色為0分；染色陽(yáng)性細(xì)胞率>50%為3分，26%～50%為2分，5%～25%為1分，<5%為0分。在最終統(tǒng)計(jì)中，將兩項(xiàng)分值相加：其中>4分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，3分為陽(yáng)性(++)，2分為弱陽(yáng)性(+)，1分為陰性(-)。并將PBS作為陰性對(duì)照，而以結(jié)腸癌陽(yáng)性表達(dá)切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組間比較采用χ2檢驗(yàn)，組間等級(jí)資料比較采用行×列表χ2檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片制備結(jié)果

在此次研究中共制備3個(gè)5×10組織芯片蠟塊，均通過(guò)規(guī)則的點(diǎn)陣方式植入相同直徑的組織樣本中，并且點(diǎn)陣排列規(guī)整，其形態(tài)可觀測(cè)率達(dá)到96.38%。

2.2 LIMK1蛋白在不同結(jié)腸組織中的表達(dá)

LIMK1在5例遠(yuǎn)離結(jié)腸癌的正常組織中呈弱陽(yáng)性，且主要位于結(jié)腸淺表黏膜。在結(jié)腸上皮內(nèi)瘤變中呈強(qiáng)陽(yáng)性4例，陽(yáng)性3例，較正常黏膜組織表達(dá)水平有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而LIMK1在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中表達(dá)則顯著高于正常黏膜組織(P<0.05)。LIMK1在結(jié)腸癌患者病理切片中主要呈中～強(qiáng)陽(yáng)性，其中強(qiáng)陽(yáng)性14例，陽(yáng)性33例，弱陽(yáng)性8例，顯著高于正常黏膜和腺瘤。見(jiàn)表1。

表1 LIMK1在不同結(jié)腸組織中的表達(dá)(例，%)

2.3 LIMK1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

研究結(jié)果表明，LIMK1的表達(dá)與患者的年齡、分化程度無(wú)關(guān)，與腫瘤的大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 LIMK1表達(dá)同結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

3 討論

LIMK1基因長(zhǎng)度為39499 bp，位于染色體7q11.23,RNA編碼LIMK1蛋白，在惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并參與機(jī)體生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架重建以及腫瘤形成[2-3]。LIMK1屬于絲氨酸蛋白激酶，通過(guò)磷酸化能夠促使微管解聚，從而有利于腫瘤細(xì)胞侵襲。腫瘤細(xì)胞在侵襲過(guò)程中表現(xiàn)為“邊緣隆起-黏附-回縮”周期性活動(dòng)，從而使得細(xì)胞能夠“前進(jìn)”，因而形成“侵襲性偽足”，由肌動(dòng)蛋白聚合形成微絲系統(tǒng)。絲切蛋白(cofilin)和肌動(dòng)蛋白解聚因子家族(actin depolimeriaing factor,ADF)在微絲的形成和解聚中發(fā)揮重要作用。LIMK1能夠?qū)⑽挥赾ofilin/ADF蛋白第3位的絲氨酸磷酸化，致使其無(wú)法解聚肌動(dòng)蛋白，從而促使偽足形成，產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)。有研究表明[4]，LIMK1致使cofilin蛋白磷酸化與去磷酸化間的平衡發(fā)生輕微的變動(dòng)是決定腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的關(guān)鍵。

有臨床研究證實(shí)[5]，LIMK1在不同類型的惡性腫瘤中均大量表達(dá)，如人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人肺癌H1299細(xì)胞等，并以不同的機(jī)理和方式發(fā)生浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移。同其它正常的前列腺上皮細(xì)胞P69和BPH-1比較，前列腺M(fèi)21和M12細(xì)胞中LIMK1表達(dá)水平隨著惡性腫瘤發(fā)展而增加，M21和LNCaP細(xì)胞中LIMK1表達(dá)高1～2倍，而轉(zhuǎn)移性DU145和PC3則要高出7～8倍。此外，高侵襲性的M21和PC3細(xì)胞中LIMK1水平普遍高于低侵襲性細(xì)胞。轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞中存在高度磷酸化的絲切蛋白，通過(guò)抑制LIMK1的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞遲滯在G2/M期，改變細(xì)胞生物學(xué)特性，改變其正常形態(tài)，遏制細(xì)胞增殖和分化，從而遏制轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞的侵襲性。此外，有報(bào)道顯示[6-7]，前列腺癌中與浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因位點(diǎn)位于7q11.2，而人類LIMK1基因位點(diǎn)7q11.23，表明兩者具有一定程度的關(guān)聯(lián)。LIMK1在人乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，則顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，血液轉(zhuǎn)移和肝肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高度增加。

有學(xué)者通過(guò)免疫組化顯示[8]，LIMK1在絕大多數(shù)乳腺腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，并且超過(guò)50%在細(xì)胞核中表達(dá)，而正常乳腺細(xì)胞中僅有不到40%在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且進(jìn)一步證據(jù)表明，LIMK1能夠促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Chhavi等[9]采取Western blot法檢測(cè)子宮頸正常組織、子宮頸癌組織和上皮內(nèi)瘤變中LIMK1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，宮頸癌組織中LIMK1含量高于健康組織和CIN的5倍和2倍。而LIMK1高度表達(dá)的患者死亡率為53.85%,顯著高于LIMK1低表達(dá)患者的17.63%，表明LIMK1表達(dá)水平不僅與子宮頸癌的侵襲能力呈正相關(guān)，而且影響患者的預(yù)后。

在此次研究過(guò)程中，LIMK1在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平顯著高于健康組織。LIMK1的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的年齡大小、分化程度無(wú)關(guān)，與腫瘤的大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)，是結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)，極有可能是結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要生物標(biāo)志和治療靶點(diǎn)，值得我們進(jìn)一步深入研究。

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