周 琰 張 星 陸志剛 姚 陽

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是源于間葉組織以能產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細胞為特征的惡性腫瘤，占原發(fā)性骨惡性腫瘤的首位[1]。OS好發(fā)于青少年，惡性度高，進展迅速，常早期發(fā)生血行或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。隨著新輔助化療等的應(yīng)用，患者5年生存率有所提高，已從上個世紀70年代的10%～15%提高到目前的50%～70%[2-3]。影響骨肉瘤轉(zhuǎn)歸最主要的原因是其轉(zhuǎn)移率極高，而肺是最常見器官，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的5年生存率顯著降低不足20%。近年許多學(xué)者著重研究與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)的分子途徑，本研究關(guān)注了細胞外基質(zhì)的重要組分——纖維連結(jié)蛋白(fibronectin,FN)。FN最初是在培養(yǎng)的雞胚成纖維細胞上發(fā)現(xiàn)的1種纖維細胞表面抗原，主要作用是介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與基質(zhì)粘連結(jié)合，促進細胞分化、定向遷移。FN在骨肉瘤組織中的表達及其與預(yù)后的相關(guān)性的相關(guān)研究較少。本研究旨在探討FN表達與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集自2010年1月至2012年1月上海市第六人民醫(yī)院收治的、經(jīng)病理活檢確診為初發(fā)骨肉瘤病例36例，均為保肢術(shù)后接受了一線大劑量密集MTX、ADM+DDP、IFO方案交替化療12個療程，化療結(jié)束后門診隨訪2年，肺轉(zhuǎn)移18例，男性11例，女性7例，中位年齡14.6歲。無肺轉(zhuǎn)移18例，男性10例，女性8例，中位年齡13.3歲。

1.2 主要試劑

兔抗人FN多克隆抗體，SP免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測法

石蠟標本制成4 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸入3%H2O2溶液中，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，3 min×3次。0.01M枸椽酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)微波爐加熱至95 ℃左右，放入切片加熱10～15 min，進行抗原修復(fù)，滴加試劑A一正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min，傾去血清，勿洗。滴加1∶50稀釋的兔抗人多克隆抗體FN一抗(福州邁新公司)，4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出PBS沖洗，3 min×3次。滴加試劑B一生物素標記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育15 min。PBS沖洗，3 min×3次。滴加試劑C一辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min。PBS沖洗，滴加新鮮配置的DAB溶液，在顯微鏡下控制顯色。背景染色出現(xiàn)前終止染色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染2 min，蒸餾水充分洗滌。用已知陽性組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果分析

FN陽性為腫瘤細胞胞質(zhì)和(或)細胞膜出現(xiàn)棕黃色染色。參考過氧化物酶染色評分標準，對陽性細胞數(shù)量及染色強度進行評分。評分標準為：1分為陽性顆粒所占細胞面積為1/2以下；2分為陽性顆粒所占細胞面積為1/2～2/3；3分為陽性顆粒所占細胞面積為4/5，但顆粒邊界清晰；4分為陽性顆粒所占細胞面積為4/5以上，且顆粒聚集分界不清。統(tǒng)計500個細胞中陽性細胞數(shù)及陽性積分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。兩樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織中FN表達的相關(guān)性分析

肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤組織中FN表達陽性率明顯高于非肺轉(zhuǎn)移組，且多呈彌漫性棕黃色顆粒，評分多在3分以上；而非肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤組織中其陽性細胞百分比明顯下降，且陽性棕黃色顆粒多占細胞面積的2/3以下，評分多在1～2分，兩組比較差異有顯著性(P<0.01)，見表1。

表1 FN在肺轉(zhuǎn)移和非肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤組織中表達的差異

*為與非肺轉(zhuǎn)移組比較，P<0.05。

2.2 FN表達與骨肉瘤臨床病理特征的相關(guān)性

非肺轉(zhuǎn)移組中FN表達陽性率及積分與骨肉瘤腫瘤大小、腫瘤分期相關(guān)，而與腫瘤組織學(xué)分級無關(guān)，見表2。肺轉(zhuǎn)移組FN表達僅與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，見表3。

表2 非肺轉(zhuǎn)移組FN表達與其臨床病理特征的相關(guān)性分析

*為組間對比有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05。

表3 肺轉(zhuǎn)移組FN表達與其臨床病理特征的相關(guān)性分析

*為組間對比有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05。

3 討論

骨肉瘤占惡性腫瘤的0.2%，約75%的骨肉瘤患者年齡為15 ～ 25歲,男性多于女性(1.5∶1),年齡< 6歲或> 60歲的患者罕見。骨肉瘤通常起源于長骨的干骺端,股骨、脛骨和肱骨占大約80%，原發(fā)于骨干的腫瘤罕見，而末端骨腫瘤如手和足的腫瘤少于1%，我國每年約有6 000～7 000例新病例。由于骨肉瘤好發(fā)于骨增長時期，起病時無典型臨床癥狀，極易與外傷或生長痛混淆，而其惡性程度高，早期極有可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。近30年來，骨肉瘤的治療有了較大的突破，但就診早期出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的患者，5年生存率仍低于20%，早期鑒定可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標，對骨肉瘤生存率的提高具有重大的臨床意義。

FN 是1種含有巖藻糖和氮基乙糖的細胞外非膠原糖蛋白，腫瘤組織中FN質(zhì)與量的變化與瘤細胞的粘附、轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。Bae等[4]檢測了1 596例浸潤性導(dǎo)管癌的乳腺癌患者組織標本發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤分級，Her-2表達正相關(guān)，與無病生存率及總生存率負相關(guān)，是激素陽性浸潤性導(dǎo)管癌患者獨立預(yù)后因素。Knowles等[5-6]的研究顯示，血漿纖維連接蛋白通過形成微小血凝塊，促進腫瘤細胞的侵襲，增加黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移。同時FN通過上調(diào)Tie2，保護腫瘤細胞免受炎癥介質(zhì)的細胞毒作用。有學(xué)者[7]分析了胃腸道及其他頭頸部腫瘤患者血漿FN水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿FN水平遠高于正常對照。Pal等[8]在FN預(yù)包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)前列腺癌細胞PC3可顯著提高細胞金屬機制蛋白酶MMP9和MMP1的表達，使細胞遷移能力顯著提高。Steffens等[9]檢測腎癌組織FN表達，發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移患者原發(fā)灶FN陽性率為無轉(zhuǎn)移患者原發(fā)灶的4倍，轉(zhuǎn)移灶中FN陽性率則是無轉(zhuǎn)移病灶的7倍，回顧性分析發(fā)現(xiàn)病灶FN表達程度與患者5年生存率呈負相關(guān)。這個現(xiàn)象在卵巢癌也同樣被證實，分化不良和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)卵巢癌病例FN表達率高于無轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織[10]。FN表達水平對骨肉瘤預(yù)后有何指導(dǎo)作用呢？本研究顯示在肺轉(zhuǎn)移組骨肉瘤組織中FN蛋白呈彌漫高表達率(>80%)，遠高于非肺轉(zhuǎn)移組，差異顯著，提示FN高表達對遠處有一定預(yù)示意義。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在非肺轉(zhuǎn)移組FN表達組化陽性率及積分與骨肉瘤腫瘤大小、分期相關(guān)，與組織學(xué)分級無關(guān)，但在肺轉(zhuǎn)移組FN表達僅與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。該結(jié)果同樣驗證了FN表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的趨勢，但由于標本量較少，尚不能完全確定腫塊大小及分期與FN表達的相關(guān)性。

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