陶維紅, 秦民民, 張哲如

上海津曼特生物科技有限公司, 上海 201210

20世紀(jì)80年代初，基因重組技術(shù)開始應(yīng)用于動物細(xì)胞。1984年，Genentech公司首次實現(xiàn)重組中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞表達(dá)組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator，t-PA)，標(biāo)志著哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的建立[1]。隨后，許多外源蛋白基因相繼被轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞，一些有價值的蛋白不斷實現(xiàn)表達(dá)，包括凝血因子、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)、免疫球蛋白、尿激酶(urokinase，UK)、乙肝表面抗原(HBsAg)和單克隆抗體[2]等。近幾年，平均每年有15種以上重組蛋白新藥通過美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)[3]，并且?guī)讉€重磅生物抗體藥專利即將到期促使生物仿制藥的出現(xiàn)，全球生物抗體藥銷售額已超過1 200億美元/年[4]，預(yù)計到2015年，全球生物抗體藥銷售額將超過1 500億美元[5]。最突出的重磅炸彈級藥物包括：美羅華利妥昔單抗[Rituximab(Ritaxan)，美國Genentech和Biogen Idec公司研制]、赫賽汀曲妥珠單抗[Trastuzumab(Herceptin)，美國Genentech公司研制]、阿伐斯汀貝伐單抗[Bevacizumab(Avastin)，美國Genentech公司研制]、艾比特思西妥昔單抗[Cetuximab(Erbitux)，美國ImClone公司和Bristol-Myers Squibb公司研制]和修美樂阿木達(dá)單抗[adalimumab(Humira)，美國Cambridge抗體公司和AbboR公司研制]，這幾種單抗藥物在2011年全球銷售額分別都在近50億美元以上[6]。在國內(nèi)，生產(chǎn)單抗藥物的上市公司目前僅僅有上海的中信國建、賽金和北京的百泰，國內(nèi)市場空間巨大，很多從事小分子藥物或者中藥的企業(yè)已經(jīng)進(jìn)軍單抗藥物領(lǐng)域，包括海正藥業(yè)、復(fù)星醫(yī)藥、榮昌制藥、麗珠藥業(yè)和沃森藥業(yè)等。最近幾年，單抗藥物領(lǐng)域中小型企業(yè)也應(yīng)運而生，其中不具備單抗藥物研發(fā)平臺的企業(yè)在初始階段會考慮技術(shù)外包，于是藥明康德、睿智化學(xué)等生物醫(yī)藥研發(fā)外包公司(contract research organization，CRO)也進(jìn)入單抗藥物研發(fā)、生產(chǎn)等領(lǐng)域。但是我國動物細(xì)胞表達(dá)水平較低和發(fā)酵規(guī)模普遍偏小的現(xiàn)狀制約了我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。因此有必要對國內(nèi)細(xì)胞株開發(fā)技術(shù)策略進(jìn)行探討。

1 宿主細(xì)胞

抗體藥物生產(chǎn)的宿主細(xì)胞主要有NS0、HEK293、Hybridoma、SP2/0和CHO等[7]。其中，CHO細(xì)胞是生產(chǎn)抗體藥物應(yīng)用最廣的宿主細(xì)胞[8]，主要有以下原因[3]：①CHO細(xì)胞能夠較好地適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，在生物反應(yīng)器中可獲得較高的密度，有利于工業(yè)上大規(guī)模培養(yǎng)；②CHO細(xì)胞不易傳播人類感染病毒[9]；③CHO細(xì)胞能夠在無血清和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠確保不同批次培養(yǎng)的重現(xiàn)性；④CHO細(xì)胞能夠在翻譯后進(jìn)行修飾[10]，尤其是在糖蛋白糖基化方面，其糖型與人類基本一致；⑤dhfr和GS等基因能夠在CHO細(xì)胞實現(xiàn)共擴(kuò)增，并最終獲得目的蛋白的高表達(dá)。此外，CHO細(xì)胞類型也比較多，例如：DG44、DXB11、CHO K1和CHO-S等。自20世紀(jì)80～90年代開始，工業(yè)上較早使用的是DHFR(二氫葉酸還原酶缺陷型)基因擴(kuò)增篩選系統(tǒng)，宿主細(xì)胞株為DG44[11～13]。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)含有甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)時，二氫葉酸還原酶被抑制，通過反饋調(diào)節(jié)，使得該基因進(jìn)行擴(kuò)增[14]，其上下游100～1 000 kb范圍內(nèi)的基因都會隨之?dāng)U增，因此將目的基因插入此位點范圍即可得到擴(kuò)增。現(xiàn)在很多單抗生產(chǎn)的體系依然是DG44的DHFR體系。GS(谷氨酰胺合成酶)擴(kuò)增系統(tǒng)，以CHO-K1為宿主細(xì)胞，是近些年發(fā)展的一種新型基因擴(kuò)增篩選系統(tǒng)，較DHFR系統(tǒng)有明顯的優(yōu)越性，目前在國際上得到了廣泛的認(rèn)可[15～17]。其原理是GS在ATP水解提供能量的同時，利用細(xì)胞內(nèi)的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏外源谷氨酰胺的培養(yǎng)基中加入GS抑制劑甲硫氨酸亞砜亞銨(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及與之相連的目的基因得到有效擴(kuò)增，從而達(dá)到提高目的基因表達(dá)水平的目的。該系統(tǒng)的優(yōu)點主要在[17]：不需要基因缺陷型的CHO-K1細(xì)胞株作為宿主細(xì)胞；CHO-K1細(xì)胞易于培養(yǎng)，更強(qiáng)壯；在培養(yǎng)基中無需加谷氨酰胺，能夠避免谷氨酰胺分解造成培養(yǎng)體系中氨水平高的問題，降低了工藝控制的難度，并且可有效提高細(xì)胞發(fā)酵密度和延長細(xì)胞生存時間。

2 表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染策略

適合于CHO細(xì)胞表達(dá)的載體(Vector)的基本元素包括：啟動子(promoter)、poly A 加尾信號(poly A signal)、篩選標(biāo)記(selectable marker)、克隆位點(cloning site)和復(fù)制起始位點(origin of replication)，有些還有報告基因(reporter gene)。啟動子一般較多采用SV40和CMV兩種，CMV啟動子通常位于目的基因(輕鏈和重鏈可變區(qū)基因)之前，而SV40則位于篩選標(biāo)記之前。篩選標(biāo)記一般有兩種：代謝型和抗生素型，或者也可稱為擴(kuò)增型基因篩選標(biāo)記和非擴(kuò)增型基因篩選標(biāo)記。常見的篩選標(biāo)記見表1，當(dāng)前工業(yè)界較多采用的篩選標(biāo)記為DHFR、GS、G418和puromycin等。

表1 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中常用的篩選標(biāo)記

Li等[18]研究顯示，在載體設(shè)計中插入篩選標(biāo)記的不同策略，會影響最終的篩選結(jié)果。為比較不同質(zhì)粒構(gòu)建和篩選策略，分別設(shè)計了兩種質(zhì)粒，一種帶有DHFR單個篩選標(biāo)記， 另一種帶有GS單個篩選標(biāo)記，兩種質(zhì)粒都同時具有輕鏈和重鏈基因。共進(jìn)行五組實驗：Ⅰ轉(zhuǎn)染質(zhì)粒一，加入25 nmol/L MTX進(jìn)行篩選；Ⅱ轉(zhuǎn)染質(zhì)粒二，加入25 μmol/L MSX進(jìn)行篩選；Ⅲ轉(zhuǎn)染質(zhì)粒二，加入50 μmol/L MSX進(jìn)行篩選；Ⅳ混合轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒，加入25 nmol/L MTX和25 μmol/L MSX進(jìn)行篩選；Ⅴ混合轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒，加入25 nmol/L MTX和50 μmol/L MSX進(jìn)行篩選。比較上述轉(zhuǎn)染后的篩選結(jié)果顯示，Ⅳ和Ⅴ條件篩選的高表達(dá)的克隆數(shù)量明顯較高。因此，這種采用兩種篩選標(biāo)記的質(zhì)粒構(gòu)建與篩選方法又稱雙重篩選(double selection)，比單篩選標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后篩選效率高很多。

目前，商業(yè)中所選擇的載體供應(yīng)商主要是Life technologies公司，從pcDNA3系列到Freedom pCHO1.0，其大小由原來的4 000～5 000 bp到現(xiàn)在的近13 000 bp不等。圖1～圖3分別顯示了三種典型的載體圖譜(均來自www.lifetechnologies.com)。pcDNA3.1是Life technologies公司早期開發(fā)的載體，其構(gòu)造相對較簡單。pOptiVEC-TOPO載體的最大特點在于具有TOPO酶和IRES(internal ribosome entry site)組件。TOPO酶具有無縫克隆的特點，與多克隆位點相比，優(yōu)勢在于插入目的基因時不會帶有酶切位點；而IRES組件的功能主要是能夠?qū)⑺B接的兩個基因共用同一個啟動子進(jìn)行表達(dá)[3]，即pOptiVEC-TOPO(4 420 bp)上的CMV啟動子同時作用于目的基因和DHFR篩選標(biāo)記基因。Freedom pCHO1.0是Life technologies最新開發(fā)的一個載體，大小為12 988 bp，具有以下特點：①目的基因的輕鏈和重鏈可以同時插入一個載體上，以前的載體設(shè)計多數(shù)是插入一個輕鏈或者重鏈；②外源基因插入位點之前設(shè)計的啟動子在CMV基礎(chǔ)上進(jìn)行了較大的改善；③具有兩個篩選標(biāo)記。在啟動子的設(shè)計上面，尤其是對于使用DHFR或GS這類擴(kuò)增型基因篩選標(biāo)記的表達(dá)體系，目的基因前面的啟動子一般比篩選標(biāo)記的啟動子轉(zhuǎn)錄活性要強(qiáng)[19]。

圖1 pcDNA3.1圖譜

圖2 pOptiVEC-TOPO圖譜

圖3 Freedom pCHO1.0圖譜

3 轉(zhuǎn)染方法

轉(zhuǎn)染類型一般有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染兩種。在單抗細(xì)胞株篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前通常通過瞬時轉(zhuǎn)染得到一些抗體，進(jìn)行質(zhì)量分析，以初步判斷抗體是否滿足需要；或者進(jìn)行一些前期的啟動子、密碼子等組件的優(yōu)化。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。在CHO細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時，外源DNA整合到CHO染色體上，未整合的游離態(tài)的DNA會隨傳代而丟失。

常用于哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法有磷酸鈣法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子聚合物法和電穿孔法，在工業(yè)界使用最多的是陽離子脂質(zhì)體法和電穿孔法[18]。

4 篩選技術(shù)

CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后，通常會做一個克隆池(pool)，然后進(jìn)行篩選。篩選策略主要涉及抗生素或藥物的代謝途徑，常見的篩選試劑包括puromycin、G418、MTX和MSX等。Puromycin為氨基糖甙類抗生素，通過干擾核糖體功能阻斷哺乳動物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，來自鏈霉菌的pac基因具有解除嘌呤霉素(puromycin)毒性的作用。在篩選的時候，puromycin濃度一般在10 ～50 μg/mL。G418也是一種氨基糖苷類抗生素，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑之一。G418在篩選的時候一般濃度范圍為200～1 000 μg/mL。MTX為葉酸拮抗劑，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過轉(zhuǎn)換后可抑制DHFR的活性，抑制核酸合成，引起細(xì)胞毒性。Schimke等[14]的研究顯示，隨著MTX濃度的增加，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞中，DHFR基因得以擴(kuò)增，目的基因拷貝數(shù)隨之增加，提高了表達(dá)量。MTX篩選時，一般濃度范圍為25～1 000 nmol/L。MSX篩選采用的是谷氨酰胺合成酶基因GS系統(tǒng)壓力。谷氨酰胺合成酶(GS)擴(kuò)增系統(tǒng)是新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)，具有更高的擴(kuò)增效應(yīng)。MSX篩選時，一般濃度范圍：25～500 μmol/L。

4.1篩選方法

哺乳動物細(xì)胞篩選穩(wěn)定的細(xì)胞株常用的方法主要有三種：96孔單克隆有限稀釋法[20]、流式細(xì)胞儀法[21]和Clone Pix System篩選法[22]。

96孔單克隆有限稀釋法是早期最廣泛應(yīng)用的單克隆細(xì)胞株篩選法，理論上可以得到非常均一的單克隆，同時可以篩選懸浮細(xì)胞穩(wěn)定株。其缺點是工作量比較大,效率較低。流式細(xì)胞儀法主要針對膜蛋白或者內(nèi)分泌抗體，具有一定的局限性[3]。流式細(xì)胞儀可同時進(jìn)行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。在應(yīng)用中，通常細(xì)胞目的基因帶有熒光報告蛋白基因或者加入帶有熒光標(biāo)記的抗抗體。

Clone Pix System篩選法是目前工業(yè)上較為流行的篩選法[3]，是由Molecular Devices公司開發(fā)的自動挑選克隆的設(shè)備，較有限稀釋法具有更高篩選效率(表2)。該方法使用半固體培養(yǎng)基，將細(xì)胞固定在半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行生長，并在半固體培養(yǎng)基中加入帶有熒光標(biāo)記的二抗，通過與細(xì)胞表達(dá)的抗體進(jìn)行結(jié)合，形成熒光光圈，在熒光顯微鏡下可以看出所謂的“光暈”。如果光暈越大、熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，理論上說明克隆表達(dá)量越高，也即篩選所得的克隆。Clone Pix System儀器主要結(jié)合這一原理，能夠快速挑選高表達(dá)的單一克隆。與其配套的Clone Select Imager儀器可以客觀定量評估孔板中的細(xì)胞生長，判斷是否是單個克隆。最近出現(xiàn)了與Clone Pix System類似的篩選儀器，是德國ALS(Automated Lab Solutions)公司開發(fā)的Cell Celector[23]，應(yīng)用范圍更廣。

表2 有限稀釋法和Clone Pix System方法比較

在工業(yè)上，單克隆細(xì)胞大部分是懸浮培養(yǎng)，所以在篩選細(xì)胞株的時候，應(yīng)該盡量接近工業(yè)生產(chǎn)條件。結(jié)合實踐經(jīng)驗來看，在篩選細(xì)胞株早期，應(yīng)該考慮將細(xì)胞靜止培養(yǎng)轉(zhuǎn)向搖床或者動態(tài)培養(yǎng)，以便篩選出更為穩(wěn)定的、接近生產(chǎn)型的細(xì)胞株。篩選穩(wěn)定、高表達(dá)的細(xì)胞株，一般周期需要6～12個月。

4.2篩選準(zhǔn)則以及檢測方法

克隆的篩選通常關(guān)注滴度水平及單位時間單個細(xì)胞所表達(dá)的抗體量(cell specific productivity，Qp)選擇克隆的Qp在所有克隆中至少要排在中等。工業(yè)上所用的克隆Qp一般在20～100 pg/cell·d。同時還要關(guān)注克隆生長狀態(tài)，工業(yè)上CHO細(xì)胞的翻倍時間一般為15～24 h，在批次培養(yǎng)或者流加培養(yǎng)的時候，平臺期能夠盡量長些。

在孔板期間滴度的檢測一般通過ELISA方法或者均相時間分辨熒光技術(shù)(homogeneous time resolved fluorescence，HTRF)[24]，后者是目前高通量篩選克隆常用的檢測方法。HTRF技術(shù)是對時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移的檢測技術(shù)(time-resolved fluoresence resonance energy transfer assay，TR-FRET assay)平臺的進(jìn)一步改良，可提供更高的靈敏度和穩(wěn)定性。該技術(shù)是法國Cisbio Bioassays公司的專利技術(shù)。最近又有一種新的微量檢測方法出現(xiàn)，該方法稱為ForteBio Octet分析法[25]，采用生物膜干涉技術(shù)，與ELISA法相比，Octet平臺自動化程度高，測定的速度快，更貼近搖瓶和反應(yīng)器中細(xì)胞表達(dá)量測定的試驗需要，但其費用可能偏高，暫時沒有在測定孔板滴度中得到廣泛的應(yīng)用。

篩選的克隆到達(dá)搖瓶之后，應(yīng)盡快建立研究型細(xì)胞庫(research cell banking,RCB)，做穩(wěn)定性試驗?？疾炜寺〉姆€(wěn)定性一般會傳代至60代，并觀察克隆生長的穩(wěn)定性，即翻倍時間的穩(wěn)定性；克隆表達(dá)的穩(wěn)定性，即滴度或者Qp的穩(wěn)定性；克隆遺傳的穩(wěn)定性；以及克隆質(zhì)量的穩(wěn)定性，即克隆前后表達(dá)抗體的質(zhì)量是否有較大差別?？寺∵M(jìn)入搖瓶的同時，還會進(jìn)行cDNA序列的鑒定、肽圖分析、CE-SDS和SDS-PAGE單抗純度分析等，主要為避免抗體氨基酸序列突變或克隆的丟失；進(jìn)行HPLC-SEC分析，以剔除容易形成多聚體的克??；進(jìn)行糖型分析，盡量避免一些糖型較差的克??；進(jìn)行等電聚焦電泳(isoelectric focusing electrophore-sis，IEF)或者成像毛細(xì)管等電聚焦電泳(imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF)，以及離子交換色譜HPLC分析，避免一些產(chǎn)生高酸或高堿變體的克隆等。

克隆在搖瓶考察后，需要選定一定數(shù)量的克隆進(jìn)入反應(yīng)器進(jìn)行評價，主要考察細(xì)胞生長、單抗表達(dá)和單抗質(zhì)量等。一般篩選克隆會做1～2次亞克隆，以確保是單克隆。當(dāng)然如果在初期母克隆篩選的時候能夠確保是單克隆，可以不做亞克隆。

5 培養(yǎng)工藝

細(xì)胞株開發(fā)的過程中，一般需要在一定的培養(yǎng)工藝平臺基礎(chǔ)上進(jìn)行克隆篩選。中試生產(chǎn)申報藥品臨床試驗(investigational new drug，IND)時，一般會選定2～3個來自不同系列的克隆，其中1～2個克隆作為備選。

培養(yǎng)工藝對最終生物制品的產(chǎn)量、質(zhì)量和安全有巨大影響，其中以細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇最為重要[7]。在篩選培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基時，初期流加培養(yǎng)時候基礎(chǔ)培養(yǎng)基和同品牌的補(bǔ)料培養(yǎng)基應(yīng)該配對進(jìn)行篩選。初步篩選之后，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行分類，如促進(jìn)生長類型、維持活率類型、促進(jìn)表達(dá)類型等。將培養(yǎng)基進(jìn)行混合優(yōu)化時，盡量將不同類型的培養(yǎng)進(jìn)行組合，并且應(yīng)用實驗設(shè)計(design of experiment，DOE)優(yōu)化。

在補(bǔ)料策略方面，普遍將基礎(chǔ)培養(yǎng)進(jìn)行濃縮后添加到補(bǔ)料培養(yǎng)基中，因為基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般營養(yǎng)比較全面，但也有可能導(dǎo)致滲透壓偏高。一般來講，補(bǔ)料體積應(yīng)該在終體積的40％以內(nèi)。有的策略會按照天數(shù)和一定的補(bǔ)料體積來補(bǔ)加，有的會按照細(xì)胞密度來補(bǔ)加，也有按照葡萄糖濃度來補(bǔ)加，或者按照一定代謝狀態(tài)補(bǔ)加等。

6 展望

目前中國抗體藥物產(chǎn)業(yè)正進(jìn)入關(guān)鍵的發(fā)展時期，在細(xì)胞株開發(fā)方面需要不斷堅持自主創(chuàng)新，吸取國外先進(jìn)的技術(shù)，結(jié)合自身發(fā)展需要，選擇CHO K1或者CHO-S為宿主細(xì)胞、谷氨酰胺合成酶表達(dá)體系，結(jié)合Clone Pix System半固體培養(yǎng)基方式挑選克隆，利用商業(yè)培養(yǎng)基快速推進(jìn)IND申報，同時開發(fā)自己的培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)工藝平臺模式，選擇合適的產(chǎn)業(yè)化方式，促使整個抗體藥物產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

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