房軍帆，杜俊英，梁 宜，方劍喬

(浙江中醫(yī)藥大學，杭州310053)

非放射性EMSA法檢測AP-1蛋白DNA結(jié)合活性實驗優(yōu)化

房軍帆，杜俊英，梁 宜，方劍喬*

(浙江中醫(yī)藥大學，杭州310053)

目的 探索一種方案簡便，儀器要求較低，且有效的非放射性凝膠電泳遷移率(EMSA)的檢測方法。方法 以AP-1蛋白為實驗對象，自制退火緩沖液合成生物素標記AP-1探針，抽提炎癥大鼠脊髓背角處核蛋白(無需純化)，取10 μg核蛋白與探針室溫反應30 min。小型聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳后將探針濕轉(zhuǎn)至正電子加強尼龍膜上，紫外交聯(lián)，ECL顯影。通過正常探針與變性探針的競爭實驗，證明方法的可靠性。結(jié)果 自制退火緩沖液成功合成生物素標記AP-1探針;炎癥大鼠脊髓背角處AP-1蛋白與正常探針的結(jié)合后產(chǎn)生明顯滯后條帶，且結(jié)合力遠高于變異探針。結(jié)論 優(yōu)化后的非放射性EMSA方案，有效降低了實驗花費和儀器要求，且結(jié)果可信。

凝膠電泳遷移率(EMSA);AP-1;凝膠電泳;實驗優(yōu)化

凝膠電泳遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，又稱凝聚阻滯實驗或凝膠電泳遷移率檢測，是一種用于研究轉(zhuǎn)錄因子和其相關的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，能對各類轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性進行定性和半定量分析，是一項研究細胞信號轉(zhuǎn)導通路的關鍵實驗技術(shù)。該實驗技術(shù)操作較為復雜，不少學者［1-2］從不同的角度對該技術(shù)的優(yōu)化改進進行了探討。但這些討論大多針對放射性EMSA技術(shù)。對非放射性EMSA技術(shù)的討論現(xiàn)尚少見。AP-1是最常見的轉(zhuǎn)錄因子之一，參與多種基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控［3］。本實驗室立足自身條件，建立了一種簡單、實用的非放射性EMSA實驗方法，現(xiàn)以AP-1蛋白的DNA結(jié)合活性檢測為例，介紹如下。

1 材料

1.1 實驗試劑 EDTA、Hepes(美國SIGMA公司)，Poly(dI·dC)(美國Thermo公司)，細胞核和細胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天)，BCA法蛋白定量試劑盒(碧云天)，其余試劑均為市售分析純級。

1.2 主要儀器 垂直電泳槽和電泳儀(美國BIO RAD公司)，紫外分光光度計(美國BIO RAD公司)，Image LAS4000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.3 寡核甘酸單鏈 上海生物工程公司訂購生物素標記的AP-1探針寡核甘酸單鏈(AP-1)和突變AP-1探針寡核苷酸單鏈(AP-1m)，未標記的AP-1探針寡核甘酸單鏈和突變AP-1探針寡核苷酸單。

1.4 緩沖液配置 STE退火緩沖液［10 mmol/L Tris(pH 8.0)，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA］、5 ×TBE 緩沖液(pH 8.3)［450 mmol/L Tris，450 mmol/L硼酸，10 mmol/L EDTA］。結(jié)合緩沖液［20 mmol/L Hepes，pH 7.6，75 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，5 mmol/L MgCl2，50 ng/μL Poly(dI·dC)，2.5% 甘油，0.05%NP-40］。

1.5 樣本和取材 雄性健康SD大鼠，弗氏完全佐劑致炎后3 d，取腰段(L4～6)患側(cè)脊髓背角，－80℃保存。

2 實驗方法

2.1 探針合成 嚴格按說明書操作溶解各單鏈，如表1配置各管。

表1 探針合成 μL

混勻，95℃水浴5 min，自然冷卻，4℃保存。使用前50×稀釋生物素標記探針，得20 fmol/μL生物素標記探針和4 pmol/μL未標記探針。

2.2 合成探針檢測 上樣5 μL，行1%瓊脂糖、90 V電壓凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)拍攝并分析。

2.3 核蛋白提取 本實驗選用細胞核和細胞漿抽提試劑盒，嚴格按照說明書操作，－80℃保存。

2.4 核蛋白定量 本實驗采用BCA法進行蛋白定量，嚴格按照試劑盒要求操作。

2.5 EMSA反應體系配置 特異性結(jié)合測試，如表2設置反應體系，室溫孵育1 h。

表2 EMSA反應體系配置 μL

2.6 電泳 6%聚丙烯酰胺非變性凝膠。每管反應體系加入 Loading Buffer 5 μL，抽打均勻后，上樣20 μL。100 V 恒壓電泳35 min。

2.7 轉(zhuǎn)印 電泳完畢，取出凝膠，切除多余部分，將其與正電子加強Nylon膜、濾紙置于0.5×TBE緩沖液中浸泡15 min，按濾紙、正電子加強尼龍膜、凝膠、濾紙的順序排列，逐層排盡空氣，裝入轉(zhuǎn)印槽中，以380 mA恒流濕轉(zhuǎn)30 min。

2.8 紫外交聯(lián) 將轉(zhuǎn)印好的Nylon膜略瀝干后置于紫外交聯(lián)儀中，254 nm波長、120 mJ/cm2能量紫外交聯(lián)1 min。

2.9 HRP標記和顯影 Nylon膜在封閉液中封閉15 min，再入含HRP的封閉液孵育15 min，清洗5 min×4次。ECL試劑1∶1混勻后，滴加到Nylon膜上室溫反應3 min。瀝干后，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍攝。

3 實驗結(jié)果

3.1 雙鏈DNA探針合成比對 各泳道合成探針均位于25 bp附近，與理論計算值接近。其中第2泳道和第4泳道探針亮度明顯高于第1泳道和第3泳道，表明未標記的雙鏈DNA寡合苷酸濃度高于生物素標記的雙鏈DNA寡合苷酸(圖1)。

圖1 AP-1探針濃度檢測

3.2 AP-1蛋白DNA結(jié)合活性檢測 本實驗通過調(diào)整不同核蛋白提取物的加樣量，保證每管反應體系中的核蛋白均為10 μg。結(jié)果如圖2所示，圖像下方的濃黑色條帶為未與蛋白結(jié)合的自由探針條帶，圖像上方深淺不一的條帶是標記探針與蛋白反應的滯后條帶。通過競爭實驗證明，AP-1探針與蛋白結(jié)合具有很強的特異性，改變2個位點后即無法與相應的蛋白產(chǎn)生結(jié)合反應(圖2)。

3.3 超凈臺紫外燈交聯(lián)效果 除普通紫外交聯(lián)儀外，紫外燈也具有一定的紫外交聯(lián)效果。如圖3所示，該結(jié)果為造模后不同時間，大鼠脊髓背角處AP-1蛋白結(jié)合活性的改變，該圖為采用超凈臺紫外燈進行紫外交聯(lián)。與圖2相比無明顯差距。

圖2 AP-1探針特異性檢測

圖3 超凈臺紫外燈紫外交聯(lián)結(jié)果

4 討論

常用實驗技術(shù)中免疫組化、免疫印跡(Western Blotting)和EMSA均可用于轉(zhuǎn)錄因子檢測，但三者的側(cè)重點各有不同。免疫組化或免疫熒光技術(shù)可以較準確的反應轉(zhuǎn)錄因子的表達部位和表達細胞，Western Blotting可以精確定量轉(zhuǎn)錄因子。但并非所有轉(zhuǎn)錄因子均可以與DNA結(jié)合以刺激基因轉(zhuǎn)錄，唯有EMSA技術(shù)可以反映轉(zhuǎn)錄因子是否具有DNA結(jié)合活性，故EMSA是證明細胞信號轉(zhuǎn)導通路最終效應的必要實驗技術(shù)。目前，隨著在基礎研究［4-5］和中醫(yī)藥理論及研究［6-8］中針對信號轉(zhuǎn)導通路的研究變的越來越多，EMSA技術(shù)隨之開始在逐漸普及。該技術(shù)原理是將標記過的特異性寡核苷酸探針與核蛋白一起孵育，具有DNA結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄因子會與探針結(jié)合。由于蛋白質(zhì)的分子量遠遠大于探針，故凝膠電泳時蛋白結(jié)合探針的電泳速率慢于自由探針，形成滯后條帶，具有結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄因子被分離，并可通過各種成像技術(shù)檢測。同時進行的競爭實驗則可以證明探針的特異性。競爭實驗中加入過量未標記的探針，通過與標記探針競爭性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，使滯后條帶消失。冷競爭實驗中加入過量未標記的突變探針，對滯后條帶則幾乎無影響。

筆者認為，EMSA方法靈敏度高，但其操作較為復雜。完整的EMSA操作過程包括探針的合成與標記，探針與DNA的結(jié)合，電泳，轉(zhuǎn)印，顯影等多個步驟，任一步驟發(fā)生錯誤均可能導致整個實驗的失敗，故對其反應條件和實驗方法進行優(yōu)化勢在必行。筆者結(jié)合實驗室自身條件，反復嘗試，對其中的幾個關鍵步驟進行了優(yōu)化，并成功完成了相關實驗檢測［9］。

探針的標記，傳統(tǒng)的EMSA技術(shù)多使用放射性同位素標記探針。該標記法的優(yōu)點是靈敏度高，但同位素的放射性嚴重威脅實驗人員的健康，且半衰期較短，不宜保存，對實驗技術(shù)有很高的要求。采用生物素標記探針，化學發(fā)光法進行檢測的EMSA技術(shù)，在保證靈敏性前提下，避免了對人體健康的威脅，是一種值得推廣的探針標記方法。但直接在雙鏈寡核苷酸探針上標記生物素［10］，其標記效率底下，且效率不穩(wěn)定。每次標記完成都需要測量標記效率，大大增加了工作強度。理論上，單鏈探針不會與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，因而不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，筆者發(fā)現(xiàn)可直接頂購標記好的單鏈寡核苷酸，自行退火合成雙鏈探針。退火合成的雙鏈探針其標記效率接近100%，不僅避免了反復測量標記效率的繁瑣實驗步驟，且在一定程度上提高了實驗的靈敏性。

核蛋白抽提，理論上使用純化的核蛋白是最佳選擇，但是大多數(shù)實驗室并不具備相關技術(shù)和儀器。常規(guī)提取的核蛋白只要適度延長孵育時間一樣可以得出良好的結(jié)果。如上述實驗中，AP-1探針與核蛋白的孵育時間為1 h。

電泳參數(shù)，探針的分子量多在20～30 bp之間，而蛋白質(zhì)的分子量卻大多在30 KD以上，故兩者間電泳速率差極大。同時，由于DNA探針和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合是一個可逆過程，故應采用高電壓電泳以防止探針和蛋白的解離。但高電壓電泳會增大發(fā)熱量，除冰浴外還需進行預電泳以降低電流強度。但預電泳會進一步加大探針和轉(zhuǎn)錄因子之間的電泳速率差。為了保證圖像的完整性，多需要采用15 cm長度以上的大型膠進行實驗。筆者通過反復優(yōu)化得出，當被測轉(zhuǎn)錄因子的分子量小于50 KD時，在8 cm長度的小型膠上，采用如下電泳參數(shù)可獲得較滿意的實驗結(jié)果:無預電泳，100 V恒壓電泳35 min。

簡易紫外交聯(lián)，高品質(zhì)的尼龍膜和良好的紫外交聯(lián)不僅可以得到較好的實驗結(jié)果，更可以延長實驗結(jié)果的保存期限。常規(guī)的紫外交聯(lián)儀即勝任。但如實驗室缺乏相應的設備，可以使用超凈臺的紫外燈代替。超凈臺內(nèi)照射15 min可以獲得一定的交聯(lián)效果。交聯(lián)后采用自封袋保存尼龍膜，正常室溫下可以儲存1周。

經(jīng)過如上改進，不僅減少了EMSA實驗的耗費，降低了對實驗設備的要求，且易于獲得背景干凈，條帶清晰的實驗結(jié)果。優(yōu)化后的EMSA實驗，結(jié)果穩(wěn)定，可重復性高，并適用與其他核轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合活性的檢測。

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［1］蒲澤錦，吳靈飛.核因子-κB電泳遷移率變動分析方法的改進［J］.汕頭大學醫(yī)學院學報，2005，18(3):169-171，174.

［2］王勇，黃文華.一種改進的核轉(zhuǎn)錄因子的電泳遷移率改變分析法［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2001，23(1):119-120.

［3］Sharma-Walia N，Krishnan H H，Naranatt P P，et al.ERK1/2 and MEK1/2 induced by Kaposi＇s sarcoma-associated herpesvirus(human herpesvirus 8)early during infection of target cells are essential for expression of viral genes and for establishment of infection［J］.J Virol，2005，79(16):10308-10329.

［4］李波，田芳，陳華民，等.c-di-GMP抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Clpxoo與葡聚糖酶基因啟動子的結(jié)合［J］.微生物學報，2013，53(11):1166-1171.

［5］Datta G，F(xiàn)uller B J，Davidson B R.Molecular mechanisms of liver ischemia reperfusion injury:insights from transgenic knockout models［J］.World J Gastroenterol，2013，19(11):1683-1698.

［6］楊薔，舒鵬.中藥逆轉(zhuǎn)胃癌細胞多藥耐藥機制研究［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2013，29(2):266-268.

［7］王高超，張琪.中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)心力衰竭心肌重塑研究進展［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2012，28(6):1110-1112.

［8］閆穎，楊宇，袁建，等.三甲散加減方對實驗性肝纖維化大鼠TGF-β1/Smads信號通路的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2009，29(11):997-1000.

［9］杜俊英，房軍帆，梁宜，等.電針對 CFA大鼠脊髓背角CREB的DNA結(jié)合活性影響研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2014(1):50-53，226.

［10］Ray P，Rialon-Guevara K L，Veras E，et al.Comparing human pancreatic cell secretomes by in vitro aptamer selection identifies cyclophilin B as a candidate pancreatic cancer biomarker［J］.J Clin Invest，2012，122(5):1734-1741.

Optimized non-radioactive EMSA for detecting AP-1 protein DNA binding activity

FANG Junfan，DU Junying，LIANG Yi，F(xiàn)ANG Jianqiao*
(Zhejiang University of Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China)

Abstract:ObjectiveTo explore a lower instrument required，easier program and effective non-radioactive electrophoretic mobility shift assay(EMSA)detection methods.MethodsWith AP-1 proteins as experimental subject，nuclear protein was extracted from spinal cord dorsal horn of inflammatory rats.10 μg nuclear protein responded with AP-1 probe 30 min at room temperature，which was synthesized by homemade annealing buffer synthetic.After non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，probe was transferred to the positron reinforced nylon membrane，UV crosslinking and exposured by ECL.To check the effective of the protein-DNA interactions，competitive EMSA was performed.ResultsAP-1-probe was synthesized by homemade annealing buffer synthetic.AP-1 probe bound very efficiently to the AP-1 protein extracted from spinal cord dorsal horn of inflammatory rats，and the competitive probe did not contain appreciable level of binding ability.ConclusionThe optimized non-radioactive EMSA effectively reducing the experimental cost and equipment requirements，and the results are credible and worthy of promotion.

Key words:EMSA;AP-1;gel electrophoresis;experiment optimized

R285.5

A

2095－6258(2014)04－0600－04

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.014

國家自然科學基金資助項目(30873305)，浙江省“重中之重”學科(針灸推拿學)建設經(jīng)費資助(浙教高科［2008］255號)，浙江省自然基金資助項目(Y2091151)。

房軍帆(1985－)，男，博士研究生。研究方向:針灸鎮(zhèn)痛與免疫調(diào)節(jié)。

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方劍喬，男，教授，電子信箱:fangjianqiao7532@163.com。

張海洋

2014－01－25)