裘蘭蘭,李悅,林銳,何華,3Δ,朱鳴陽

(1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 鹽城,224005;2.中國藥科大學(xué) 分析化學(xué)教研室,南京 210009;3.中國藥科大學(xué) 天然藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210009)

光譜法研究山柰酚與牛血清白蛋白的相互作用

裘蘭蘭1,李悅2,林銳1,何華2,3Δ,朱鳴陽2

(1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 鹽城,224005;2.中國藥科大學(xué) 分析化學(xué)教研室,南京 210009;3.中國藥科大學(xué) 天然藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210009)

目的 利用熒光光譜研究了山柰酚與BSA之間的相互作用。方法 利用Stern-Volmer方程，計(jì)算山柰酚分子與牛血清白蛋白的出雙分子碰撞猝滅常數(shù)Kq和靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)Ka。結(jié)果 雙分子碰撞猝滅常數(shù)Kq分別為15.20×1012L/（mol·s)（298 K)，13.41 ×1012L/（mol·s)（310 K)，10.70 ×1012L/（mol·s)（318 K)，靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù) Ka分別為 3.491 ×105L/mol（298 K)，8.183×105L/mol（310 K)，11.35×105L/mol（318 K)，并能形成一個結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論 中藥小分子山柰酚分子確實(shí)與牛血清白蛋白結(jié)合，且通過靜態(tài)猝滅的方式對BSA的內(nèi)源熒光進(jìn)行猝滅。

光譜法；山柰酚；牛血清白蛋白；相互作用

山柰酚(kaempferol),化學(xué)名為3,4',5,7-四羥基黃酮,來源于姜科植物山柰、小檗科植物窩兒七等多種植物的根莖、全草及干燥成熟果實(shí)中(見圖1)［1-2］。近年來,山柰酚因其顯著的藥理作用及良好的生物利用度了廣大醫(yī)藥工作者的關(guān)注,在臨床上表現(xiàn)為具有抗菌、止咳、支氣管炎、糖尿病、白內(nèi)障、抗癌、抗癲癇、抗氧化劑、解痙、抗?jié)?、利膽利尿等?-5］。探索山柰酚入藥后在人體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)過程極其關(guān)鍵,特別是對山奈酚與人體內(nèi)蛋白質(zhì)的作用模式的研究,更具有實(shí)際意義。本實(shí)驗(yàn)室之前也報(bào)道了一些關(guān)于中藥小分子與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行結(jié)合的研究［6-10］。本文在前期工作的基礎(chǔ)上,使用熒光光譜法研究了山柰酚與牛血清蛋白的作用模式,作用機(jī)制以及山奈酚在牛血清白蛋白上的作用位置。

圖1 山柰酚的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of kaempferol

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 日本島津RF-5301 PC熒光分光光度計(jì);離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(蘭州物理化學(xué)研究所);三羥甲基氨基甲烷(Tris,上海精細(xì)化工試劑有限公司);山柰酚(南京澤朗生物科技有限公司);牛血清白蛋白(BSA,Amresco公司);其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 山柰酚用離子液體溶液配制成4.6×10-4mol/L儲備液備用。牛血清白蛋白用Tris-HCl緩沖液(pH 7.4,其中含0.1mol/LNaCl))制成5.0μmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液于冰箱中4℃保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確移取3mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液置于比色皿中,以山奈酚溶液作為滴定劑,使用微量注射器逐次加入,具體加樣體積由實(shí)驗(yàn)時濃度進(jìn)行計(jì)算得到(滴定劑累加體積小于100μL)。分別在25℃、37℃和45℃下,在激發(fā)波長為278 nm,分別掃描298,310和318 K下290～500 nm波長范圍的熒光光譜。

2 結(jié)果

2.1 山柰酚對BSA的熒光猝滅光譜 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中含有色氨酸和酪氨酸基團(tuán),而這些基團(tuán)是蛋白質(zhì)產(chǎn)生熒光的內(nèi)在來源。 在 BSA中依次加入0、1.5、3.0、4.5、6.0、8.5、11.0 μmol/L山柰酚后進(jìn)行掃描所得的熒光圖譜見圖2。隨著山柰酚濃度的增加,BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的降低,最大發(fā)射波長出現(xiàn)了明顯藍(lán)移現(xiàn)象。這表明山柰酚使BSA的熒光發(fā)生猝滅的現(xiàn)象。

圖2 山柰酚對BSA的熒光猝滅圖譜Fig.2 Fluorescence spectra of BSA in the presence of varying concentrations of kaempferolc(BSA)=5.0μmol/L,λex=280 nm,pH 7.40,T=298 K

2.2 山柰酚對BSA的熒光猝滅方式 熒光猝滅有2種形式,分別是動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。當(dāng)溫度升高時,有效碰撞的離子數(shù)目增加,電子的轉(zhuǎn)移變快,熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)增加,這種形式稱為動態(tài)猝滅;反之,當(dāng)溫度升高時,復(fù)合物的穩(wěn)定性減弱,猝滅常數(shù)減小,這種形式稱為靜態(tài)猝滅［11］。

動態(tài)猝滅的過程遵循Stem-Volmer方程,方程式如下:

式中F0和F分別為加入猝滅物質(zhì)前和加入猝滅分子后熒光分子的強(qiáng)度,Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù),τ0為不存在猝滅物質(zhì)時熒光分子的平均壽命;［Q］為猝滅物質(zhì)濃度,Ksv為Stem-Volmer猝滅常數(shù)［12］。

本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法研究了不同溫度(298,310和318 K)下的山柰酚與牛血清白蛋白相互作用,根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以BSA的F0/F為縱坐標(biāo),山柰酚濃度c為橫坐標(biāo)作圖(見圖3)。

圖3 不同溫度下山柰酚-BSA相互作用的Stern-Volmer曲線Fig.3 Stern-Volmer plot for the anction of BSA and kaempferolpH 7.40, λex=280 nm and λem=349 nm.

由圖3可見,在不同溫度下,所得的Stern-Volmer曲線具有良好的線性關(guān)系,且曲線的斜率的溫度降低而升高。根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出Kq值(見表1),數(shù)量級都大于1012。而猝滅劑對蛋白質(zhì)的動態(tài)猝滅常熟最大為2.0×1010L/(mol·s)。實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)大于此值,且速率常數(shù)隨溫度降低而升高,這2者都說明藥物與牛血清白蛋白確實(shí)發(fā)生了作用,而且應(yīng)該為靜態(tài)猝滅,主要原因是形成了復(fù)合物。

表1 不同溫度下山柰酚-BSA的猝滅常數(shù)Tab.1 Stern-Volmer quenching constant of the systems of Kaempferol-BSA at different temperatur

2.3 結(jié)合常數(shù)KA與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n 山奈酚與蛋白質(zhì)之間為靜態(tài)猝滅,靜態(tài)猝滅公式［13-14］如下:

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以lg(F0-F)/F為縱坐標(biāo),lg［Q］為橫坐標(biāo)作圖,得到一條直線,如圖4。

圖4 不同溫度下山柰酚-BSA復(fù)合物的lg［(F0-F)/F］對lg［Q］圖Fig.4 The plots of lg［(F0-F)/F］vs lg［Q］ at 298,310 and 318K

由直線方程式可求出山柰酚與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n(見表2)。由表2數(shù)據(jù)可以看出,山柰酚與BSA的KA值均達(dá)到105,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n等于1,說明2者的相互作用挺強(qiáng)。還能觀察到當(dāng)溫度升高時,結(jié)合常數(shù)由3升高到11,這說明溫度對山奈酚與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合能力的影響較大。

表2 山柰酚與BSA的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTab.2 The binding constant(Ka)and the number of binding sites(n)

2.4 作用力類型的確定 藥物與蛋白質(zhì)之間的作用力包括范德華力、靜電引力、疏水力等等。可以根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔH和熵變ΔS的大小,判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力［14］。

由式3,4可求得298 K下山奈酚與BSA反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù),見表3。

表3 山柰酚與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab.3 Thermodynamic parameters for the association of kaempferolwith BSA

由表3可見:ΔH＞0,ΔS＞0,說明2者之間以疏水作用為主;ΔG＜0,表明2者結(jié)合反應(yīng)是由焓、熵驅(qū)動的自發(fā)過程。

3 討論

山柰酚濃度的增加,蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的降低,2者之間存在相互作用,山柰酚與BSA之間形成了復(fù)合物,發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。猝滅常數(shù)隨著溫度升高而降低,說明山柰酚與BSA之間的猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算出310K時結(jié)合常數(shù)為8.183×105,表明山柰酚與BSA之間的自發(fā)結(jié)合能力較強(qiáng),形成一個結(jié)合位點(diǎn),山柰酚與BSA之間的作用力類型以疏水作用力為主,且為自發(fā)過程。

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(編校:吳茜)

Study on the interactions between kaem p ferol and bovine serum album in by spectroscopy and molecular docking method

QIU Lan-lan1,LIYue2,LIN Rui1,HE Hua2,3Δ,ZHU Ming-yang2

(1.Yancheng Health Vocational and Technical College,Yancheng 224005,China;2.Division of Analytical Chemistry,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China;3.Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Objective The interaction of kaempferol with bovine serum albumin(BSA)was studied by fluorescence spectra.The quenching constants Kq at different temperatures were determined using Stern-Volmer equation.The Kq were 15.20×1012L/(mol·s)(298K),13.41×1012L/(mol·s)(310K),10.70×1012L/(mol·s)(318K).The binding constants(Ka)were 3.491×105L/mol(298 K),8.183×105L/mol(310 K),11.35×105L/mol(318 K).It shows kaempferol combinates the Trp212 of BSA,and the coaction of non-raditive energy transfer and static quenching quenches the intrinsic fluorescence of BSA.

spectroscopy;kaempferol;BSA;interaction

R631

A

1005-1678（2014)06-0175-03

國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J0630858)；鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年基金(20114105)

裘蘭蘭，女，碩士，講師，研究方向：現(xiàn)代儀器分析技術(shù)，E-mail：qiu-0520@163.com；何華，通信作者， E-mail：dochehua@163.com。