冷瀟，周艷，唐海明，張祥，劉佳，楊佩，王衍堂＊

（1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，成都 610083；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，成都 610041）

伴隨動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)近半個世紀以來的飛速發(fā)展，基因敲除動物已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域極為重要的工具之一［1］。由于小鼠與人類遺傳基因高達85%的同源性，小鼠成為除人類以外的第二個完成全基因組測序的哺乳動物。同時，大量的基因敲除小鼠品系已建立，并應(yīng)用于基因功能研究［2］。但因為整體敲除動物易發(fā)生胚胎致死突變，以及基因在多個器官系統(tǒng)敲除后，出現(xiàn)生物學(xué)功能的相互干擾，影響基因敲除效應(yīng)分析的準(zhǔn)確性等問題，對敲除動物在基因功能研究中的深入應(yīng)用產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)睦_。條件性基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)完美地規(guī)避了以上問題，其通過將某種細胞特異性表達重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠和靶基因鉗制小鼠雜交，得到在該種特定類型的細胞靶基因特異性敲除且敲除階段完全可控的轉(zhuǎn)基因小鼠，從而為靶基因在特異組織或器官的功能研究提供了一個極為優(yōu)秀的平臺［3，4］。

本課題組研究的目標(biāo)基因Perp，在外周T淋巴細胞發(fā)育以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中均起著重要作用。但Perp全身敲除的純合子小鼠因為皮膚上皮細胞橋粒功能的缺陷，極易自發(fā)廣泛且嚴重的表皮內(nèi)松解性大皰，極少能存活至成年期，在出生2w內(nèi)即出現(xiàn)大量死亡［5，6］。因此，筆者從美國Jackson實驗室引進了Perp基因條件敲除鼠（conditional knock out mic，cKO mice）以及 Lck－Cre轉(zhuǎn)基因小鼠［7］，借助Cre-LoxP位點特異性重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建Perp基因在免疫系統(tǒng)中特異性敲除的工具小鼠，并以此為基礎(chǔ)進一步在整體動物水平研究Perp基因在T細胞發(fā)育以及在自身免疫疾病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物PerpcKO雜合子型（Perpfl/＋）小鼠及Lck-Cre雜合子小鼠均購自美國Jackson實驗室。小鼠引進后在成都醫(yī)學(xué)院科研實驗中心SPF級實驗動物房進行實驗與繁殖。

1.1.2 主要實驗試劑 基因組DNA提取純化試劑盒（Wizard）；PCR試劑盒（Fermentas）；熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa）；兔抗鼠Perp多克隆抗體（Santa Cruz）。

1.2 實驗方法

1.2.1Perp條件基因敲除小鼠的建立 由于引進的Perp條件敲除小鼠均為雜合子，所以采用1只雄鼠與1只雌鼠進行合籠繁殖，其F1子代小鼠可能出現(xiàn)野生型（Perp＋/＋）、雜合子（Perpfl/＋）和純合子（Perpfl/fl）3種表型。故需應(yīng)用PCR以及電泳法在子代3～4w時進行Perp基因loxp位點的鑒定。將鑒定為純合子（Perpfl/fl）的F1代小鼠繼續(xù)采用1只雄鼠與1只雌鼠進行合籠繁殖，F(xiàn)2代小鼠則只會出現(xiàn)純合子（Perpfl/fl）表型。繼續(xù)將Perpfl/fl純合子小鼠與Lck-Cre雜合子小鼠雌雄合籠，應(yīng)用PCR以及電泳法進行Perp基因loxp位點以及表達Cre重組酶的鑒定，篩選得到Perpfl/＋×LckCre/＋小鼠，即為實驗需要的Perp基因T淋巴細胞特異性敲除小鼠。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及水平電泳 PCR反應(yīng)引物由上海生工合成，引物序列見表1。采用PCR擴增儀（ABI）進行Perptm2Att序列和Generic Cre序列的循環(huán)擴增，設(shè)置的反應(yīng)條件分別見表2、表3。取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物3μL在1%瓊脂糖凝膠電泳，DL2000作為DNA分子量標(biāo)記物，10V/cm進行電泳，全自動凝膠圖像系統(tǒng)（Bio-rad）分析成像并保存。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

表2 Perptm2Att序列的PCR反應(yīng)條件

表3 Generic Cre序列的PCR反應(yīng)條件

1.2.3 qPCR以及Western Blot檢測Perp表達水平 脫臼處死小鼠，取出脾臟，制備脾細胞懸液。注入尼龍毛柱（日本和光公司），37℃，5%CO2孵箱孵育1h，得到純化的T細胞。應(yīng)用Trizol法抽提細胞RNA，以此為模板，借助逆轉(zhuǎn)PCR試劑盒（TAKARA），通過PCR反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計Perp基因的實時熒光定量PCR反應(yīng)引物序列：Perpforward，5｀-GACCCCAGATGCTTGTTTTC-3｀；Perpreverse，5｀-ACCAG-GGAGAT GATC TGGAA-3｀。應(yīng)用 qPCR 試劑盒 （TAKARA），在Real-time PCR儀（Bio-rad）上分析Perp基因在脾臟T淋巴細胞中的表達水平。

應(yīng)用細胞裂解及蛋白抽提試劑盒（碧云天）從脾臟T細胞中提取總蛋白，BCA法（Termo）測定蛋白濃度后，應(yīng)用Western Blot法測定在脾臟T淋巴細胞中Perp蛋白的表達水平。全自動凝膠圖像系統(tǒng)（Bio-rad）分析成像并保存。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Perpflox小鼠的繁殖、生長及鑒定

Perpflox雜合子小鼠雌雄合籠繁殖出F1子代小鼠，子代小鼠基因型鑒定結(jié)果見圖1。篩選出的F1代Perpflox純合子小鼠，繼續(xù)雌雄合籠繁殖出F2子代小鼠，經(jīng)鑒定全部為Perpflox純合子小鼠。

圖1 Perpflox小鼠基因型的鑒定結(jié)果

2.2 表達Cre重組酶小鼠的繁殖、生長及鑒定

T淋巴細胞特異性表達Cre重組酶的小鼠與Perpflox純合子小鼠雌雄合籠繁殖。對F1代小鼠進行基因型鑒定，篩選得到表型為Lck-Cre×Perpfl/＋的雜合子小鼠。將Lck-Cre×Perpfl/＋的雜合子小鼠繼續(xù)雌雄合籠繁殖。對F2代小鼠進行基因型鑒定，篩選得到表型為 Lck-Cre×Perpfl/fl的Cre重組酶陽性的純合子小鼠即為實驗需要的小鼠基因型。部分小鼠的鑒定結(jié)果見圖2。

2.3 Lck-Cre×Perpflox/flox小鼠脾臟T細胞中Perp的表達水平

應(yīng)用熒光定量PCR及Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)Lck-Cre×Perpflox/flox小鼠脾臟T細胞的Perp基因的RNA及蛋白表達水平與Lck-Cre×Perp＋/＋小鼠相比顯著降低（見圖3）。

3 討論

條件性基因敲除（conditional knockout）是將某個基因在生物特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段靜默的基因打靶方法，是在常規(guī)基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶介導(dǎo)的位點特異性重組技術(shù)，在生物基因敲除的范圍和時間上均處于一種可控狀態(tài)。借助這一新型的條件打靶技術(shù)，實現(xiàn)了基因在時間和空間上特異性敲除的效果，從而可以避免關(guān)鍵基因在完全性敲除（complete knockout）后的胚胎致死以及發(fā)育缺陷等問題［8，9］。條件性基因敲除的實現(xiàn)則主要依賴Cre-LoxP和FLP-frt重組系統(tǒng)，這兩個系統(tǒng)是真核細胞內(nèi)染色體位點特異性重組酶的同源系統(tǒng)。其主要原理為在待敲除的一段目標(biāo)DNA序列的兩端各放置一個loxP（或Frt）序列，得到flox（flanked by loxP）小鼠。將flox小鼠與帶有細胞特異性表達的Cre（或Flp）的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細胞里把目標(biāo)基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠［10］。與 FLP/frt重組系統(tǒng)相比，Cre/LoxP重組系統(tǒng)在構(gòu)建條件性基因敲除小鼠的應(yīng)用中更為廣泛，主要有以下原因：1）Cre酶的活性較Flip酶更高，且Cre酶的最適反應(yīng)溫度在37℃左右，與哺乳動物的體溫非常接近，而Flip酶的最適溫度是30℃，優(yōu)化后的活性依然不如Cre酶。2）Cre-LoxP系統(tǒng)經(jīng)過20多年的發(fā)展和應(yīng)用，尤其在免疫學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)研發(fā)了大量的Cre酶工具鼠，以至于目前絕大部分應(yīng)用于條件敲除的工具鼠都是Cre酶工具鼠，因此借助Cre-LoxP系統(tǒng)可以將flox小鼠與更多的工具鼠交配，將極大地拓展筆者研究的廣度［11，12］。

圖2 表達Cre重組酶的小鼠基因型的鑒定結(jié)果

本課題組研究的目標(biāo)基因Perp位于6號染色體6q24區(qū)域。由于Perp基因是凋亡調(diào)控中的關(guān)鍵基因，與上皮細胞橋粒功能以及皮膚腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此，Perp基因的完全性敲除小鼠在幼年期病死率極高，難以進行該基因功能的相關(guān)性研究。本課題組通過引進Perp基因條件敲除鼠以及Lck-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建Perp基因在免疫系統(tǒng)中特異性敲除的工具小鼠，并借助PCR擴增以及瓊脂糖電泳法對Perpflox小鼠和表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠進行基因型鑒定，保證了應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)進行條件敲除前的flox小鼠和Cre小鼠是預(yù)想的基因型背景（見圖1、2）。在構(gòu)建完成 Lck-Cre×Perpfl/fl的條件敲除小鼠后，進一步應(yīng)用熒光定量PCR反應(yīng)和western blot法驗證了小鼠脾臟T淋巴細胞中Perp基因mRNA和蛋白的表達水平（見圖3），證實在Perp基因條件敲除后，在目標(biāo)類型的細胞上靜默效果完全符合預(yù)期。

圖3 Lck-Cre×Perpflox/flox小鼠脾臟T細胞中Perp的表達分析

綜上所述，Lck-Cre×Perpfl/fl的條件敲除小鼠成功構(gòu)建，將有利于我們在整體動物水平研究Perp基因在T細胞發(fā)育以及在自身免疫疾病發(fā)病中的作用。

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