徐琳 鄒婷

摘 要：目的 用薄膜過濾法和平板傾注法對無酒精口腔洗劑一類的醫(yī)療用品進行初始污染菌檢測，選擇適合此類產(chǎn)品的檢測方法。方法 采用ISO 11737-1： 2006醫(yī)療器械的滅菌-微生物方法-第一部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計，對供試品進行初始污染菌檢測試驗。結(jié)果 用薄膜過濾法對無酒精口腔洗劑進行檢測，總平均菌落數(shù)是8cfu/件；用平板傾注法對無酒精口腔洗劑進行檢測，總平均菌落數(shù)是1800cfu/件。結(jié)論 對無酒精口腔洗劑此類產(chǎn)品檢測時，宜采用薄膜過濾法。

關鍵詞：薄膜過濾法；平板傾注法

隨著近幾年來經(jīng)濟發(fā)展迅猛，科技進步加快，人們的生活水平提高，對醫(yī)療衛(wèi)生用品的需求也越來越多，企業(yè)也根據(jù)人們的需求生產(chǎn)出了一系列產(chǎn)品。這就需要檢驗人員根據(jù)不同的產(chǎn)品制定合適的檢測方案。本文就無酒精口腔洗劑，采用薄膜過濾法和平板傾注法對其初始污染菌檢測進行探討。

一、材料與試劑

（一）試驗材料。試驗樣品為某公司生產(chǎn)的無酒精口腔洗劑，400ml/瓶，綠色。

（二）試驗菌種。大腸埃希菌〔CMCC（B）44102〕第三代；金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕第三代；枯草芽孢桿菌〔CMCC

（B）63 501〕第三代；白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕第三代；黑曲霉〔CMCC（F） 98 003〕第四代；均購買自中科院微生物研究所。

（三）試劑。0.9%NaCl溶液（國藥集團化學試劑有限公司）；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（中國腹瀉病控制上海試劑供應研究中心）；虎紅培養(yǎng)基（RBA）（北京奧博星生物技術有限責任公司）；大豆酪蛋白消化物肉湯培養(yǎng)基（SCDB）（中國腹瀉病控制上海試劑供應研究中心）。

（四）儀器。高壓滅菌器；生化培養(yǎng)箱；超凈工作臺；生物安全柜。

二、試驗方法

（一）平板傾注法方法驗證。（1）菌懸液制備 用0.9%無菌氯化鈉溶液將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物制備成50-100 cfu/ml的菌懸液備用，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物制備成50-100 cfu/ml的孢子懸液備用。（2）試驗組 取樣品原液2 ml，分別接種于2個平板，每平板1 ml，同時每平板加入1 ml菌懸液，每平板注入15-20 ml培養(yǎng)基后培養(yǎng)；（3）菌液組 取菌懸液2 ml，分別接種于2個平板，每平板1 m，每平板注入15-20 ml培養(yǎng)基后培養(yǎng)。（4）樣品對照組 取樣品原液2 ml，分別接種于2個平板，每平板1 m，每平板注入15-20

ml培養(yǎng)基后培養(yǎng)。（5）進行三次獨立的平行試驗。（6）平均回收率。平均回收率（%）=×100%。（7）判斷標準平均回收率≥70%。（8）結(jié)果。（9）結(jié)論 平均回收率≥70%，可以在此條件下進行細菌、霉菌計數(shù)。

（二）平板傾注法。（1）洗脫液 0.9%NaCl溶液。（2）樣品處理 以無菌操作轉(zhuǎn)移試驗樣品（SIP=1ml）至10ml洗脫液中，于旋渦混合器（2800轉(zhuǎn)/分鐘）中振蕩2min備用。（3）細菌培養(yǎng) 產(chǎn)品洗脫液2ml，分別接種于2個平板，每平板1ml。每平板注入20ml TSA，30-35℃培養(yǎng)3-7天。（4）霉菌培養(yǎng) 產(chǎn)品洗脫液

2ml，分別接種于2個平板， 每平板1ml。每平板注入20ml RBA，20-25℃培養(yǎng)5-7天。（5）計數(shù) 按菌落計數(shù)原則進行計數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，計算出每件產(chǎn)品的菌落數(shù)（cfu/件）。

（三）薄膜過濾法方法驗證。（1）菌懸液制備 用0.9%無菌氯化鈉溶液將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物制備成50-100 cfu/ml的菌懸液備用，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物制備成50-100 cfu/ml的孢子懸液備用。（2）試驗組 取無酒精口腔洗劑100ml，同時加入1 ml菌懸液，過濾后，將膜放在瓊脂平皿上，30-35℃培養(yǎng)3-7天。（3）菌液組 取菌懸液2 ml，分別接種于2個平板，每平板1 m，每平板注入15-20

ml培養(yǎng)基后培養(yǎng)。（4）樣品對照組 過濾100ml的無酒精口腔洗劑，將膜放在瓊脂平皿上，30-35℃培養(yǎng)3-7天。（5）進行三次獨立的平行試驗。

三、結(jié)果

表1 薄膜過濾法檢測結(jié)果

表2 平板傾注法檢測結(jié)果

四、討論

由以上兩表得知，用薄膜過濾法對無酒精口腔洗劑進行檢測，總平均菌落數(shù)是8cfu/件；用平板傾注法對無酒精口腔洗劑進行檢測，總平均菌落數(shù)是1800cfu/件。如果以此結(jié)果來作為生產(chǎn)過程的常規(guī)控制，或以此來為了確立滅菌過程的處理程度，兩者結(jié)果相比，平板傾注法會產(chǎn)生較大的誤差，會給企業(yè)的分析帶來誤導，會給后續(xù)的判斷帶來一系列的誤差。

平板傾注法是直接吸取洗脫液，傾注培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，試驗簡單易操作，但對于含菌數(shù)少的產(chǎn)品來說，用此類的方法進行試驗，容易漏檢。洗脫時產(chǎn)品上殘留的微生物越多，對后續(xù)產(chǎn)品滅菌后殘留微生物的概率就相對比較大，因此，這樣方法對微生物集中水平較低的洗脫液的敏感度較差。

薄膜過濾法是將適當孔徑的濾膜放入過濾器，過濾樣品洗脫液，由于濾膜的作用將微生物保留在膜的表面上。然后，將濾膜放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。采用膜過濾法進行微生物檢測是一種國際公認的微生物標準檢驗方法，廣泛應用于環(huán)境檢測、化妝品、制藥工業(yè)品質(zhì)控制等領域。與平板傾注法比，濃縮效應使微生物檢測的準確度提高，不僅對于液體制劑這樣的產(chǎn)品適用，對于大件無法切割的產(chǎn)品也同樣被采納。

參考文獻：

[1] Sterilization of Medical Devices-Microbiological Method-Part 1：Determination of a Population of Microorganisms on Products， ISO11737-1：2006.

[2] 中國藥典2010第二部附錄XI J微生物限度檢查法.