陳炯+屠麗紅+陳艷新+秦勝營(yíng)

[摘要]

目的：通過(guò)應(yīng)用微流體芯片（lab-on-chip）技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌，包括霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌等細(xì)菌的靈敏度和精確度，從而建立突發(fā)公共衛(wèi)生事件現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室的解決方案。方法：分別采用Lab-on-chip平臺(tái)食源性病原體微流檢測(cè)芯片和熒光PCR方法對(duì)食源性病原菌樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析食源性微流芯片檢測(cè)方法的特異性、敏感度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性等。根據(jù)Lab-on-chip說(shuō)明書(shū)以及熒光定量PCP試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作。結(jié)果：Lab-on-chip方法的霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌檢出限為：5x103 to 103 DNA Copies/ml。特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性都獲得了良好的結(jié)果。 結(jié)論：Lab-on-chip方法具有快速、便捷、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中作為良好的檢測(cè)工具和方法。

[關(guān)鍵詞] Lab-on-chip微流體芯片；食源性致病菌；檢測(cè)方法

* “十二五”重大傳染病防治國(guó)家重大科技專(zhuān)項(xiàng)：致病菌新型分子血清型分型系統(tǒng)的建立（No. 2013ZX10004216-001-004）

[作者簡(jiǎn)介] 陳炯（1978- ），男，主管技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要從事微生物檢驗(yàn)研究工作。單位：上海市疾病預(yù)防控制中心（地址：上海市長(zhǎng)寧區(qū)中山西路1380號(hào)，郵編200336）聯(lián)系電話：13817529058，郵箱：jchen_4@scdc.sh.cn

[通訊作者] 陳敏 mchen@scdc.sh.cn 聯(lián)系電話：13671927931

Lab-on-chip for the detection of food borne pathogenic bacteria

Chen Jiong1 , Tu Lihong1, Chen Yanxin1, Qin Shengying2

(1. Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China;

2. The Bio-X Institutes of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200336, China)

Author for correspondence: Chen Min

[Abstract]Objective：To set up an onsite protocol for abrupt emergencies of public health, both the sensitivity and accuracy of the lab-on-chip forthe detection of food borne pathogenic bacterium including Vibrio cholera, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus and Shigellaare exanimated. Methods: Comparing the results from the chips and fluorescence quantitative PCR, the specificity, sensitivity, accuracy and repeatability of the Lab-on-chip are analyzed. Result: Acceptable specificity, accuracy and repeatability of the chips are achieved, the limitation of the chips for the Vibrio cholera, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus and Shigella is 5x103 to 103 DNA Copies/ml. Conclusion: Lab-on-chip is considered as a fast, convenient, efficient tool with acceptable accuracy for public health emergencies.

[Key words] Lab-on-chip, Food borne pathogen, detection method

食源性致病菌引起的感染性腹瀉是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率僅次于心血管疾病的第二大疾病。由于全球性食品貿(mào)易的快速增長(zhǎng)，目前微生物污染所引起的食源性疾病作為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題已引起人們的廣泛關(guān)注和深入研究，食源性疾病對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了巨大的威脅，食品安全已成為世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家或發(fā)展中國(guó)家食源性細(xì)菌污染都是影響食品安全的最主要原因。近幾年來(lái)全球許多國(guó)家多次爆發(fā)由上述致病菌所致的食源性疾病。特別是2012年在歐洲發(fā)生的毒黃瓜事件受到了全球的廣泛關(guān)注。以20世紀(jì)90年代后我國(guó)法定報(bào)告?zhèn)魅静〉陌l(fā)病數(shù)來(lái)看，由于食源性致病菌導(dǎo)致的疾病發(fā)病率一直名列前茅[2]?；魜y弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和出血性大腸桿菌O157等十八種病原體是引起食源性感染的重要病原體，常常在特定范圍內(nèi)引起大規(guī)模暴發(fā)流行。

如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)并確定病原體是實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè)和技術(shù)保障的核心內(nèi)容。長(zhǎng)期以來(lái)，在食源性致病細(xì)菌檢測(cè)方面以培養(yǎng)方法為主，目前也有PCR相關(guān)方法進(jìn)行檢測(cè)，但培養(yǎng)方法不僅操作繁瑣、耗時(shí)，而且容易漏檢[3]。對(duì)于PCR方法而言，其檢測(cè)通量有限，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)要求高。同時(shí)這些方法的檢測(cè)周期長(zhǎng)，如細(xì)菌的檢測(cè)方法中傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法（GB法）、SN方法，以抗體為基礎(chǔ)的免疫檢測(cè)方法等一般都需要6個(gè)小時(shí)以上的檢測(cè)時(shí)間[4]。作為應(yīng)對(duì)公共衛(wèi)生突發(fā)事件的疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)在疫情處置方面有其特殊性，不僅要求對(duì)病原體“檢得出”，還要求能夠“檢得準(zhǔn)、檢得快”，要擁有“一錘定音”的能力才滿足現(xiàn)場(chǎng)快速處置疫情的需要。

筆者旨在通過(guò)研究Lab-on-chip快速檢測(cè)方法對(duì)重要食源性病原體及危害因子的檢測(cè)應(yīng)用。此項(xiàng)研究采用的四個(gè)菌種全面考慮了這些菌株在疾病預(yù)防控制工作中的特殊地位?；魜y弧菌屬于甲類(lèi)傳染病，是突發(fā)集團(tuán)腹瀉等公共衛(wèi)生事件中必檢的工作；志賀氏菌為乙類(lèi)傳染病中最受關(guān)注的一種；沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌都屬于丙類(lèi)傳染病，其中沙門(mén)氏菌(非傷寒類(lèi))為國(guó)際疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)最為關(guān)注的傳染性致病菌，而副溶血性弧菌是包括上海在內(nèi)的沿海城市中最為常見(jiàn)的腹瀉致病菌。Lab-on-chip方法不僅能夠拓展病原體檢測(cè)的方法學(xué)研究，加強(qiáng)對(duì)食品安全的管理，而且大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，為現(xiàn)場(chǎng)處置及時(shí)提供準(zhǔn)確依據(jù)，并可以實(shí)現(xiàn)對(duì)國(guó)內(nèi)外法律法規(guī)重點(diǎn)管控的食品進(jìn)行食源性致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)與鑒定，填補(bǔ)了相關(guān)檢測(cè)空白。

1 材料

1.1試驗(yàn)菌株

霍亂弧菌（n=30）、沙門(mén)氏菌（n=36）、志賀氏菌（n=34）、副溶血性弧菌（n=31），空腸彎曲菌（n=8）、金黃色葡萄球菌（n=7）、大腸桿菌EHEC（n=7）、單核細(xì)胞李斯特菌（n=8）以上菌種均來(lái)源于上海市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 模擬樣品

模擬樣品采用奶粉中加入包括霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌在內(nèi)的多種菌株，同時(shí)加入其它食源性致病菌（包括空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌EHEC、單核細(xì)胞李斯特菌）用于準(zhǔn)確性和特異性檢測(cè)（所有菌株均稀釋至104 DNA Copies/ml）。

1.3 實(shí)際樣品

對(duì)于從市場(chǎng)中購(gòu)買(mǎi)的32份魚(yú)類(lèi)海產(chǎn)品進(jìn)行副溶血性弧菌的檢測(cè)。

1.4 試劑盒

Lab-on-chip：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN，QIAprep Spin Miniprep Kit)；芯片雜交液和洗脫液(上海佰真生物有限公司)；探針和引物由新加坡威特實(shí)驗(yàn)室合成。

熒光PCR：核酸抽提液、核酸熒光PCR檢測(cè)混合液、Taq + UNG酶由上海之江生物科技股份有限公司提供。

1.5儀器及耗材

生物芯片 (上海佰真生物有限公司)；溫度控制PCR擴(kuò)增-雜交系統(tǒng)(上海佰真生物有限公司)；芯片閱讀儀(上海佰真生物有限公司)；實(shí)時(shí)熒光PCR儀（Bio rad CFX96）。

2方法

2.1 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

以在細(xì)菌分類(lèi)鑒定學(xué)上具有重要意義的特異性基因片段作為芯片檢測(cè)的靶基因，霍亂弧菌和副溶血性弧菌采用Tu基因，沙門(mén)氏菌采用Muts毒力基因，志賀氏菌采用Reg-O-Ag基因。為了使探針?lè)肿釉谛酒仙煺归_(kāi)來(lái)，利于靶標(biāo)探針的雜交，合成時(shí)在每個(gè)探針的5加上1個(gè)氨基和15個(gè)T。引物和探針由新加坡威特實(shí)驗(yàn)室合成，正鏈引物用TAMRA熒光標(biāo)記。

2.2芯片的制備

采用醛基修飾的基片，利用合成好的探針點(diǎn)制到芯片上，氨基修飾的寡聚核苷酸探針和芯片表面的醛基相連從而固定到芯片上。在點(diǎn)樣時(shí)同時(shí)設(shè)置芯片固定陽(yáng)性對(duì)照、試驗(yàn)陽(yáng)性及陰性對(duì)照。（見(jiàn)圖1）

圖1 Lab on chip芯片點(diǎn)陣分布圖

2.3 DNA抽提

利用QIAGEN試劑盒，對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行DNA抽提。

2.4 Lab-on-chip檢測(cè)

PCR反應(yīng)：稀釋PCR control；混合PCR 反應(yīng)液(A,B兩管)，12.5ul/管；將反應(yīng)液加入芯片，每個(gè)加樣孔11.5ul；將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)；雜交反應(yīng)：雜交反應(yīng)液的配制，將870ul雜交緩沖液與30ul雜交探針混合均勻；將雜交反應(yīng)液加入芯片，每個(gè)加樣孔14.5ul，將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)；清洗：洗液，3000r/m 離心2min兩次；結(jié)果測(cè)定：掃描芯片上的條碼，將芯片插入芯片閱讀儀中進(jìn)行結(jié)果判讀。

2.5熒光PCR檢測(cè)[5]

試劑配制加樣：36ul樣品核酸熒光PCR檢測(cè)混合液，4ul（Taq酶+UNG）模板；PCR擴(kuò)增：37℃×2min、94℃×2min；再按93℃×15sec - 60℃×60sec，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃。反應(yīng)體系為40ul。

2.6 方法的特異性、準(zhǔn)確性、檢出限和重復(fù)性檢測(cè)

2.6.1 特異性檢測(cè)

選取四種目標(biāo)菌分離株各30株和其他不同菌株之間進(jìn)行特異性檢測(cè)。按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物與芯片雜交。

2.6.2 準(zhǔn)確性檢測(cè)

同時(shí)進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，比較方法的準(zhǔn)確性。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6.3 檢出限測(cè)定

取四種目標(biāo)菌的24h增菌培養(yǎng)物，制成DNA模板后，分別以10倍梯度稀釋至103-102 DNA Copies/ml，首先按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物與芯片雜交。以3次試驗(yàn)均檢出細(xì)菌的濃度作為靈敏度。

2.6.4 重復(fù)性檢測(cè)

對(duì)同一種目標(biāo)菌株進(jìn)行重復(fù)3次的試驗(yàn)，比較其重復(fù)性。

2.7 模擬樣品檢測(cè)一致性比對(duì)

用Lab-on-chip方法和熒光PCR的方法同時(shí)對(duì)加入包括霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌在內(nèi)的多種菌株，并加入包括空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌EHEC、單核細(xì)胞李斯特菌等其它食源性致病菌的奶粉樣品進(jìn)行檢測(cè)（所有菌株均稀釋至104 DNA Copies/ml）。

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

同時(shí)用Lab-on-chip方法和熒光PCR的方法對(duì)于從市場(chǎng)中購(gòu)買(mǎi)的32份魚(yú)類(lèi)海產(chǎn)品進(jìn)行副溶血性弧菌的檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 芯片檢測(cè)結(jié)果圖示見(jiàn)圖2：

圖2 芯片檢測(cè)結(jié)果圖例

3.2 芯片特異性結(jié)果：

選取霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌分離株各30株、空腸彎曲菌8株、金黃色葡萄球菌7株、大腸桿菌EHEC7株、單核細(xì)胞李斯特菌8株，進(jìn)行單盲設(shè)計(jì)后檢測(cè)，霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌的特異性分別達(dá)到100%、100%、96.7%、100%。（見(jiàn)表1-4）表明制備的芯片對(duì)目標(biāo)菌具有較好的特異性。

表1Lab-on-chip方法檢測(cè)霍亂弧菌結(jié)果準(zhǔn)確性和特異性

霍亂弧菌 Lab-on-chip方法 準(zhǔn)確性（%） 特異性（%）

檢出陽(yáng)性 檢出陰性 合計(jì)

陽(yáng)性 30 0 30 100 -

陰性 0 30 30 - 100

合計(jì) 30 30 60

表2Lab-on-chip方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌結(jié)果準(zhǔn)確性和特異性

沙門(mén)氏菌 Lab-on-chip方法 準(zhǔn)確性（%） 特異性（%）

檢出陽(yáng)性 檢出陰性 合計(jì)

陽(yáng)性 29 1 30 96.7 -

陰性 0 30 30 - 100

合計(jì) 29 31 60

表3Lab-on-chip方法檢測(cè)志賀氏菌結(jié)果準(zhǔn)確性和特異性

志賀氏菌 Lab-on-chip方法 準(zhǔn)確性（%） 特異性（%）

檢出陽(yáng)性 檢出陰性 合計(jì)

陽(yáng)性 28 2 30 93.3 -

陰性 1 29 30 - 96.7

合計(jì) 29 31 60

表4Lab-on-chip方法檢測(cè)副溶血性弧菌結(jié)果準(zhǔn)確性和特異性

副溶血性弧菌 Lab-on-chip方法 準(zhǔn)確性（%） 特異性（%）

檢出陽(yáng)性 檢出陰性 合計(jì)

陽(yáng)性 29 1 30 96.7 -

陰性 0 30 30 - 100

合計(jì) 29 31 60

3.3 芯片準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌的準(zhǔn)確性分別達(dá)到100%、96.7%、93.3%、96.7%。（見(jiàn)表1-4）

3.4 芯片檢出限測(cè)定結(jié)果：

lab-on-chip方法對(duì)霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌的檢測(cè)檢出限為 5x103 to 103 DNA Copies/ml，較熒光PCR方法的檢測(cè)檢出限為103 DNA Copies/ml。兩種方法的靈敏度相當(dāng)[6]。

3.5芯片重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果：

對(duì)每個(gè)菌株進(jìn)行的3次重復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果均一致。

3.6模擬樣品檢測(cè)方法一致性比對(duì)：

選取48個(gè)加標(biāo)食源性病原菌模擬樣本進(jìn)行熒光PCR和Lab - on - chip平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果分析和統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表5-8。

表5Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測(cè)霍亂弧菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 30 0 30 100 -

陰性 1 17 18 - 94

合計(jì) 31 17 48 97.9

表6Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測(cè)沙門(mén)氏菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 35 1 36 97 -

陰性 0 12 12 - 100

合計(jì) 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測(cè)志賀氏菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 33 1 34 97 -

陰性 1 13 14 - 93

合計(jì) 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 31 0 31 100 -

陰性 1 16 17 - 94

合計(jì) 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平臺(tái)在實(shí)際樣品中檢測(cè)副溶血性弧菌的結(jié)果

使用Lab-on-chip平臺(tái)和熒光PCR的方法對(duì)實(shí)際樣品（魚(yú)類(lèi)海產(chǎn)品）中的副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)。檢出率情況見(jiàn)表9，檢測(cè)結(jié)果一致性情況見(jiàn)表10。

表9副溶血性弧菌檢出率

項(xiàng)目 檢測(cè)數(shù) 熒光PCR法 Lab-on-chip方法

檢出數(shù) 檢出率% 檢出數(shù) 檢出率%

海產(chǎn)品 32 6 18.7 5 15.6

表10實(shí)際樣品副溶血性弧菌檢測(cè)結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 5 0 5 100 -

陰性 1 26 27 - 96.3

合計(jì) 6 26 32 96.9

4 討論

Lab-on-chip平臺(tái)是20世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的一種微流體芯片診斷分析技術(shù)。Lab-on-chip方法是按照預(yù)定位置固定在固相載體上的大量核酸分子所組成的微陣列，在一定條件下載體上的核酸分子與樣品的序列互補(bǔ)的核酸片段雜交，同時(shí)對(duì)樣品中的核酸片段標(biāo)記，在專(zhuān)用的芯片閱讀儀上進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有準(zhǔn)確、快速、便捷、高效、信息量大，無(wú)需分離培養(yǎng)，不依賴(lài)于PCR實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)等特點(diǎn)，因而發(fā)展迅速。近年來(lái)，生物芯片在食品檢測(cè)中的應(yīng)用，包括對(duì)轉(zhuǎn)基因食品、食品微生物、食品營(yíng)養(yǎng)成分、食品原料等領(lǐng)域檢測(cè)應(yīng)用越來(lái)越廣泛 [7]。

此項(xiàng)研究的試驗(yàn)結(jié)果表明，這種方法設(shè)計(jì)的探針和引物具有良好的特異性。Lab-on-chip方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比只需要對(duì)樣品進(jìn)行初增菌，無(wú)需分離培養(yǎng)，通過(guò)PCR擴(kuò)增、雜交試驗(yàn)，最快2h內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，從檢測(cè)時(shí)限方面大大縮短了現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)的檢測(cè)周期。

該研究建立了檢測(cè)食品中常見(jiàn)四種致病微生物的Lab-on-chip方法，該方法與疾病預(yù)防系統(tǒng)目前使用的熒光PCR的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果有很好的一致性，芯片重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)顯示芯片的重復(fù)性良好，穩(wěn)定性較強(qiáng)；lab-on-chip方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到5x103 to 103 DNA Copies/ml與熒光PCR方法的檢測(cè)靈敏度103 DNA Copies/ml 相當(dāng)，達(dá)到了應(yīng)急檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)要求，其精確度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性與經(jīng)典的熒光PCR相當(dāng)，因此lab-on-chip方法檢測(cè)結(jié)果可靠。同時(shí)具有快速、便捷、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

從實(shí)驗(yàn)條件來(lái)看，Lab-on-chip方法無(wú)需依賴(lài)PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)平臺(tái)，具備了實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所可移動(dòng)的優(yōu)點(diǎn)，可以作為突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室，能在突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件中大大提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，有利于疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中作為良好的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工具和方法。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Lab-on-chip方法對(duì)于霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌四種食源性致病菌的特異性分別達(dá)到100%、100%、96.7%、100%表明該方法對(duì)于四種菌的特異性良好，其中志賀氏菌的特異性較低些，源于在特異性實(shí)驗(yàn)中使用的大腸桿菌EHEC與志賀氏菌有一定的類(lèi)似基因片段所致。今后可以在芯片引物設(shè)計(jì)上進(jìn)一步加以優(yōu)化，從而使其特異性進(jìn)一步提高。另一方面，在使用目前的芯片檢出志賀氏菌的同時(shí)提示有大腸桿菌EHEC存在的可能性。

由于研究時(shí)間和實(shí)際條件的限制，在實(shí)際樣品的檢測(cè)中只選擇了海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，對(duì)于lab-on-chip方法在其他菌種實(shí)際樣品中的檢出率情況還有待進(jìn)一步的研究。

(致謝：本項(xiàng)研究得到了上海交通大學(xué)門(mén)Bio-X研究院和新加坡威特實(shí)驗(yàn)室的支持與幫助，同時(shí)得到了本中心微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室張曦主任的支持與幫助，微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的莊源等同志也參加了檢測(cè)工作，在此一并致謝!)

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jeong-Yeol Yoon. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety[J]. Sensors 2012, 12, 10713-10741

[2] 蔡炯. 食源性疾病的現(xiàn)狀與防治(綜述)[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011,15(9): 1150-1152．

[3] Yixian Wang. New Trends in Impedimetric Biosensors for the Detection of Food borne Pathogenic Bacteria [J].Sensors 2012, 12, 3449-3471

[4] GB4789-2010食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法微生物學(xué)部分[S]．

[5] 楊俊超. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與常規(guī)PCR法及細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)沙門(mén)菌的比較[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)2009，21（11）92-93

[6] 曾華. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與基因芯片法檢測(cè)HPV的比較[J]. 分子診斷與治療雜志 2013,5（3）165-169

[7] 肖進(jìn)文. 豬肉及其制品中幾種病原微生物芯片檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2010，38(18)：9478-9480，9607

陰性 0 12 12 - 100

合計(jì) 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測(cè)志賀氏菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 33 1 34 97 -

陰性 1 13 14 - 93

合計(jì) 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 31 0 31 100 -

陰性 1 16 17 - 94

合計(jì) 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平臺(tái)在實(shí)際樣品中檢測(cè)副溶血性弧菌的結(jié)果

使用Lab-on-chip平臺(tái)和熒光PCR的方法對(duì)實(shí)際樣品（魚(yú)類(lèi)海產(chǎn)品）中的副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)。檢出率情況見(jiàn)表9，檢測(cè)結(jié)果一致性情況見(jiàn)表10。

表9副溶血性弧菌檢出率

項(xiàng)目 檢測(cè)數(shù) 熒光PCR法 Lab-on-chip方法

檢出數(shù) 檢出率% 檢出數(shù) 檢出率%

海產(chǎn)品 32 6 18.7 5 15.6

表10實(shí)際樣品副溶血性弧菌檢測(cè)結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 5 0 5 100 -

陰性 1 26 27 - 96.3

合計(jì) 6 26 32 96.9

4 討論

Lab-on-chip平臺(tái)是20世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的一種微流體芯片診斷分析技術(shù)。Lab-on-chip方法是按照預(yù)定位置固定在固相載體上的大量核酸分子所組成的微陣列，在一定條件下載體上的核酸分子與樣品的序列互補(bǔ)的核酸片段雜交，同時(shí)對(duì)樣品中的核酸片段標(biāo)記，在專(zhuān)用的芯片閱讀儀上進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有準(zhǔn)確、快速、便捷、高效、信息量大，無(wú)需分離培養(yǎng)，不依賴(lài)于PCR實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)等特點(diǎn)，因而發(fā)展迅速。近年來(lái)，生物芯片在食品檢測(cè)中的應(yīng)用，包括對(duì)轉(zhuǎn)基因食品、食品微生物、食品營(yíng)養(yǎng)成分、食品原料等領(lǐng)域檢測(cè)應(yīng)用越來(lái)越廣泛 [7]。

此項(xiàng)研究的試驗(yàn)結(jié)果表明，這種方法設(shè)計(jì)的探針和引物具有良好的特異性。Lab-on-chip方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比只需要對(duì)樣品進(jìn)行初增菌，無(wú)需分離培養(yǎng)，通過(guò)PCR擴(kuò)增、雜交試驗(yàn)，最快2h內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，從檢測(cè)時(shí)限方面大大縮短了現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)的檢測(cè)周期。

該研究建立了檢測(cè)食品中常見(jiàn)四種致病微生物的Lab-on-chip方法，該方法與疾病預(yù)防系統(tǒng)目前使用的熒光PCR的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果有很好的一致性，芯片重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)顯示芯片的重復(fù)性良好，穩(wěn)定性較強(qiáng)；lab-on-chip方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到5x103 to 103 DNA Copies/ml與熒光PCR方法的檢測(cè)靈敏度103 DNA Copies/ml 相當(dāng)，達(dá)到了應(yīng)急檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)要求，其精確度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性與經(jīng)典的熒光PCR相當(dāng)，因此lab-on-chip方法檢測(cè)結(jié)果可靠。同時(shí)具有快速、便捷、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

從實(shí)驗(yàn)條件來(lái)看，Lab-on-chip方法無(wú)需依賴(lài)PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)平臺(tái)，具備了實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所可移動(dòng)的優(yōu)點(diǎn)，可以作為突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室，能在突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件中大大提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，有利于疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中作為良好的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工具和方法。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Lab-on-chip方法對(duì)于霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌四種食源性致病菌的特異性分別達(dá)到100%、100%、96.7%、100%表明該方法對(duì)于四種菌的特異性良好，其中志賀氏菌的特異性較低些，源于在特異性實(shí)驗(yàn)中使用的大腸桿菌EHEC與志賀氏菌有一定的類(lèi)似基因片段所致。今后可以在芯片引物設(shè)計(jì)上進(jìn)一步加以優(yōu)化，從而使其特異性進(jìn)一步提高。另一方面，在使用目前的芯片檢出志賀氏菌的同時(shí)提示有大腸桿菌EHEC存在的可能性。

由于研究時(shí)間和實(shí)際條件的限制，在實(shí)際樣品的檢測(cè)中只選擇了海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，對(duì)于lab-on-chip方法在其他菌種實(shí)際樣品中的檢出率情況還有待進(jìn)一步的研究。

(致謝：本項(xiàng)研究得到了上海交通大學(xué)門(mén)Bio-X研究院和新加坡威特實(shí)驗(yàn)室的支持與幫助，同時(shí)得到了本中心微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室張曦主任的支持與幫助，微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的莊源等同志也參加了檢測(cè)工作，在此一并致謝!)

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jeong-Yeol Yoon. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety[J]. Sensors 2012, 12, 10713-10741

[2] 蔡炯. 食源性疾病的現(xiàn)狀與防治(綜述)[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011,15(9): 1150-1152．

[3] Yixian Wang. New Trends in Impedimetric Biosensors for the Detection of Food borne Pathogenic Bacteria [J].Sensors 2012, 12, 3449-3471

[4] GB4789-2010食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法微生物學(xué)部分[S]．

[5] 楊俊超. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與常規(guī)PCR法及細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)沙門(mén)菌的比較[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)2009，21（11）92-93

[6] 曾華. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與基因芯片法檢測(cè)HPV的比較[J]. 分子診斷與治療雜志 2013,5（3）165-169

[7] 肖進(jìn)文. 豬肉及其制品中幾種病原微生物芯片檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2010，38(18)：9478-9480，9607

陰性 0 12 12 - 100

合計(jì) 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測(cè)志賀氏菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 33 1 34 97 -

陰性 1 13 14 - 93

合計(jì) 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 31 0 31 100 -

陰性 1 16 17 - 94

合計(jì) 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平臺(tái)在實(shí)際樣品中檢測(cè)副溶血性弧菌的結(jié)果

使用Lab-on-chip平臺(tái)和熒光PCR的方法對(duì)實(shí)際樣品（魚(yú)類(lèi)海產(chǎn)品）中的副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)。檢出率情況見(jiàn)表9，檢測(cè)結(jié)果一致性情況見(jiàn)表10。

表9副溶血性弧菌檢出率

項(xiàng)目 檢測(cè)數(shù) 熒光PCR法 Lab-on-chip方法

檢出數(shù) 檢出率% 檢出數(shù) 檢出率%

海產(chǎn)品 32 6 18.7 5 15.6

表10實(shí)際樣品副溶血性弧菌檢測(cè)結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽(yáng)性 陰性 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性

Lab-on-chip方法 陽(yáng)性 5 0 5 100 -

陰性 1 26 27 - 96.3

合計(jì) 6 26 32 96.9

4 討論

Lab-on-chip平臺(tái)是20世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的一種微流體芯片診斷分析技術(shù)。Lab-on-chip方法是按照預(yù)定位置固定在固相載體上的大量核酸分子所組成的微陣列，在一定條件下載體上的核酸分子與樣品的序列互補(bǔ)的核酸片段雜交，同時(shí)對(duì)樣品中的核酸片段標(biāo)記，在專(zhuān)用的芯片閱讀儀上進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有準(zhǔn)確、快速、便捷、高效、信息量大，無(wú)需分離培養(yǎng)，不依賴(lài)于PCR實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)等特點(diǎn)，因而發(fā)展迅速。近年來(lái)，生物芯片在食品檢測(cè)中的應(yīng)用，包括對(duì)轉(zhuǎn)基因食品、食品微生物、食品營(yíng)養(yǎng)成分、食品原料等領(lǐng)域檢測(cè)應(yīng)用越來(lái)越廣泛 [7]。

此項(xiàng)研究的試驗(yàn)結(jié)果表明，這種方法設(shè)計(jì)的探針和引物具有良好的特異性。Lab-on-chip方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比只需要對(duì)樣品進(jìn)行初增菌，無(wú)需分離培養(yǎng)，通過(guò)PCR擴(kuò)增、雜交試驗(yàn)，最快2h內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，從檢測(cè)時(shí)限方面大大縮短了現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)的檢測(cè)周期。

該研究建立了檢測(cè)食品中常見(jiàn)四種致病微生物的Lab-on-chip方法，該方法與疾病預(yù)防系統(tǒng)目前使用的熒光PCR的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果有很好的一致性，芯片重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)顯示芯片的重復(fù)性良好，穩(wěn)定性較強(qiáng)；lab-on-chip方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到5x103 to 103 DNA Copies/ml與熒光PCR方法的檢測(cè)靈敏度103 DNA Copies/ml 相當(dāng)，達(dá)到了應(yīng)急檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)要求，其精確度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性與經(jīng)典的熒光PCR相當(dāng)，因此lab-on-chip方法檢測(cè)結(jié)果可靠。同時(shí)具有快速、便捷、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

從實(shí)驗(yàn)條件來(lái)看，Lab-on-chip方法無(wú)需依賴(lài)PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)平臺(tái)，具備了實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所可移動(dòng)的優(yōu)點(diǎn)，可以作為突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室，能在突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件中大大提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，有利于疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中作為良好的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工具和方法。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Lab-on-chip方法對(duì)于霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌四種食源性致病菌的特異性分別達(dá)到100%、100%、96.7%、100%表明該方法對(duì)于四種菌的特異性良好，其中志賀氏菌的特異性較低些，源于在特異性實(shí)驗(yàn)中使用的大腸桿菌EHEC與志賀氏菌有一定的類(lèi)似基因片段所致。今后可以在芯片引物設(shè)計(jì)上進(jìn)一步加以優(yōu)化，從而使其特異性進(jìn)一步提高。另一方面，在使用目前的芯片檢出志賀氏菌的同時(shí)提示有大腸桿菌EHEC存在的可能性。

由于研究時(shí)間和實(shí)際條件的限制，在實(shí)際樣品的檢測(cè)中只選擇了海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，對(duì)于lab-on-chip方法在其他菌種實(shí)際樣品中的檢出率情況還有待進(jìn)一步的研究。

(致謝：本項(xiàng)研究得到了上海交通大學(xué)門(mén)Bio-X研究院和新加坡威特實(shí)驗(yàn)室的支持與幫助，同時(shí)得到了本中心微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室張曦主任的支持與幫助，微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的莊源等同志也參加了檢測(cè)工作，在此一并致謝!)

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jeong-Yeol Yoon. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety[J]. Sensors 2012, 12, 10713-10741

[2] 蔡炯. 食源性疾病的現(xiàn)狀與防治(綜述)[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011,15(9): 1150-1152．

[3] Yixian Wang. New Trends in Impedimetric Biosensors for the Detection of Food borne Pathogenic Bacteria [J].Sensors 2012, 12, 3449-3471

[4] GB4789-2010食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法微生物學(xué)部分[S]．

[5] 楊俊超. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與常規(guī)PCR法及細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)沙門(mén)菌的比較[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)2009，21（11）92-93

[6] 曾華. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與基因芯片法檢測(cè)HPV的比較[J]. 分子診斷與治療雜志 2013,5（3）165-169

[7] 肖進(jìn)文. 豬肉及其制品中幾種病原微生物芯片檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2010，38(18)：9478-9480，9607