彭京城 （江蘇省新沂市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 221400）

臨床中的犬瘟熱病毒感染多為急性和亞急性型，犬年齡在6月齡左右，其癥狀和病毒復制的臟器都與慢性病例有很大區(qū)別。臨床上急性病例的主要病變集中在肺臟和淋巴組織，組織病理學觀察到犬淋巴結(jié)炎和多核巨細胞性肺炎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 新沂市城區(qū)肉狗養(yǎng)殖基地，急性犬瘟熱病死犬4只，心臟、肝臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、膀胱、大腦和脾臟。

1.1.2 主要試劑 二甲苯I、二甲苯II、ph6.0、0.01的檸檬酸溶液、100%乙醇II、95%乙醇、75%乙醇、3%過氧化氫、pbs液等。

1.1.3 主要儀器 組織切片機、恒溫培養(yǎng)箱、光學顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 組織病理學檢測 臨床剖檢，采集臟器包括心臟、肝臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、膀胱、大腦和脾臟。制作組織切片，使用10%的福爾馬林中和緩沖液固定組織，石蠟包埋，切成5mm的切片，用常規(guī)的蘇木精和伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學方法 （1）脫蠟脫水：組織學切片在經(jīng)二甲苯I、二甲苯II各60min脫蠟，100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇、75%乙醇逐級脫水，每級5min。（2）抗原修復：ph6.0，0.01的檸檬酸溶液高壓煮沸3min。（3）封閉內(nèi)源性酶：在組織切片上，滴加3%過氧化氫，以組織完全覆蓋為宜，在室溫下處理20min。以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。pbs洗滌3次，5min/次。（4）封閉：滴加5%山羊血清于組織切片上，在37℃下反應30min，封閉非特異性結(jié)合位點。（5）一抗孵育：滴加最佳稀釋度的單抗(1:200)37℃復溫45min，棄去單抗，pbs洗滌3次，5min/次。（6）二抗孵育：滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗(1:500)，在37℃中反應45min洗滌6次，5min/次。（7）顯色：滴加DAB反應液，室溫下反應5～10min，顯色后充分洗滌，終止反應。（8）復染：蘇木精溶液染色30～60s，乙醇鹽酸分色2s，水中沖洗5min。（9）脫水封片：經(jīng)75%、95%、100%各級乙醇，每級3min。入乙醇和二甲苯(1:1)溶液2min，入二甲苯中5min至透明，加中性樹膠后蓋蓋玻片，封片，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學觀察

2.1.1 大腦 大腦白質(zhì)和灰質(zhì)中病理病變不明顯，在部分大腦灰質(zhì)區(qū)域觀察到小膠質(zhì)細胞靠近神經(jīng)元胞體的現(xiàn)象—嗜神經(jīng)現(xiàn)象。神經(jīng)元胞體中尼氏小體正常，無明顯組織病理學變化(見圖1)。

2.1.2 肺臟 泡腔中有大量的炎性細胞浸潤，纖維素性滲出，血管充血，出血，肺泡腔中出現(xiàn)多核巨細胞，胞漿深染，胞漿中有5～7個細胞核排列在胞體的周邊，診斷為典型的犬瘟熱多核巨細胞性肺炎(見圖2)。

2.1.3 淋巴結(jié) 光學顯微鏡下觀察，低倍鏡下可見，可見到淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)疏松，淋巴細胞減少，被膜下淋巴竇增寬，質(zhì)區(qū)染色淺，淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)不明顯。高倍鏡下，觀察到皮質(zhì)區(qū)被膜下淋巴竇和皮質(zhì)淋巴竇中，有大量吞噬異物的巨噬細胞，網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增生，淋巴結(jié)髓質(zhì)區(qū)大量淋巴小結(jié)被破壞，診斷為淋巴節(jié)炎(見圖3)。

2.1.3 膀胱 膀胱粘膜完整，在400倍光學顯微鏡下可以觀察到，在犬膀胱粘膜變移上皮中出現(xiàn)犬瘟熱病毒包涵體(見圖4)。

2.2 免疫組織化學結(jié)果

2.2.1 大腦 光學顯微鏡下觀察免疫組化切片，大腦白質(zhì)和灰質(zhì)的神經(jīng)元細胞、小膠質(zhì)細胞、錐狀細胞和星形膠質(zhì)細胞內(nèi)均沒有觀察到有犬瘟熱病毒抗原特異性染色。

2.2.2 肺臟 光學顯微鏡下觀察免疫組化切片，在肺臟的支氣管上皮細胞和巨噬細胞中觀察免疫標記呈陽性，但是陽性細胞量較少。

2.2.3 淋巴結(jié) 光學顯微鏡下觀察免疫組化切片，在淋巴結(jié)皮質(zhì)的淋巴小結(jié)中有強免疫標記陽性反應。而在髓質(zhì)區(qū)則表現(xiàn)為免疫標記呈陰性反應(見圖5和圖6)。

2.24 膀胱 在膀胱黏膜上皮中沒有觀察到包涵體免疫標記陽性反應。

圖1 腦組織輕度嗜神經(jīng)現(xiàn)象H.E.200х

圖2 多核巨細胞性肺炎 H.E.200х

圖3 淋巴結(jié)炎H.E.400х

圖4 膀胱粘膜內(nèi)包涵體 H.E.200х

圖5 淋巴結(jié)炎免疫組織化學染色H.E.200х

圖6 淋巴結(jié)炎 免疫組織化學染色H.E.400х

3 討論

本次試驗所選4只病犬年齡均小于3個月，屬于急性犬瘟熱感染病例。在肺炎致死的病犬的免疫組織化學結(jié)果可以觀察到在肺臟的部分支氣管上皮免疫標記呈陽性，但是在肺泡中很少觀察到犬瘟熱病毒免疫標記陽性的細胞。當犬瘟熱病毒感染機體后，可以增加血管的通透性，破壞機體免疫組織器官中淋巴細胞的生成，抑制體液免疫和細胞免疫作用的發(fā)揮，產(chǎn)生免疫抑制作用，肺臟是動物機體與外界聯(lián)通的臟器，容易受到各種微生物的感染，發(fā)生多種細菌和犬瘟熱病毒混合感染的情況。同時，觀察到病犬血液循環(huán)中的細胞因子的濃度減少，細因子的分泌合成受到抑制，導致動物生理功能紊亂，使動物肺炎加劇，最終導致死亡。即動物往往死于嚴重的肺炎，犬瘟熱病毒是導致其死亡的間接因素。這和本觀察到的結(jié)果相吻合，免疫組織化學觀察結(jié)果顯示，犬瘟熱病死犬的肺臟并不是犬瘟熱病毒繁殖數(shù)量最多的臟器，也就不是最適合作為分離病料的組織臟器。此外，病料組織在處理過程中也會釋放一些細胞毒性因子，在將這些處理材料用于接種細胞時，其內(nèi)的細胞毒性因子產(chǎn)生了不利于細胞的作用。另有試驗表明，在犬瘟熱感染的急性病例中，早期犬瘟熱病毒主要在巨噬細胞中繁殖，隨后在肺泡二型細胞和肺細胞中復制。組織病理學觀察結(jié)果表明，在犬膀膚粘膜上皮中可以觀察到病毒包涵體。但是在免疫組織化學染色結(jié)果并沒有染出犬瘟熱病毒包涵體。認為犬瘟熱病毒包涵體并不都對犬瘟熱病毒的抗體免疫陽性反應，有可能是因為犬瘟熱病毒包涵體中包括的是大量的病毒元件，這有可能會阻礙了特殊的單克隆抗體和病毒的抗原的結(jié)合。國外文獻記錄了使用犬瘟熱病犬的尿液作為臨床診斷犬瘟熱病毒的樣本，確定了犬瘟熱病毒通過尿液排毒，進行傳播的一個重要途徑。

淋巴結(jié)組織病理學觀察結(jié)果表明，淋巴結(jié)皮質(zhì)區(qū)T細胞和B細胞的消耗，同時伴隨有淋巴結(jié)髓質(zhì)區(qū)網(wǎng)狀細胞增生，淋巴小結(jié)消失，由增生的巨噬細胞和網(wǎng)狀細胞增生填充，淋巴結(jié)髓質(zhì)中僅殘存少量淋巴小結(jié)，診斷為淋巴結(jié)炎。采用免疫組織化學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)的皮質(zhì)部淋巴小結(jié)和皮竇中有大量免疫標記呈陽性的細胞。其密度和陽性反應強度均高于其他組織器官，與本實驗觀察到的結(jié)果相一致。B細胞在淋巴小結(jié)和邊緣被膜下淋巴竇中數(shù)量最多。而T細胞則主要集中在皮質(zhì)深部的厚層彌散淋巴組織—副皮質(zhì)區(qū)。犬瘟熱抗原物質(zhì)主要聚集在T細胞聚集的區(qū)域。這與本實驗觀察的結(jié)果相一致，犬瘟熱病毒在感染早期和急性病例中會主要感染T細胞和B細胞，同時使巨細胞和淋巴細胞壞死破裂，造成免疫抑制。

4 結(jié)論

在犬瘟熱急性病例中，淋巴組織是犬瘟熱病毒最好的分離臟器。神經(jīng)組織例如大腦作為常用的犬瘟熱病毒分離材料，但在免疫組織化學染色和組織病理學檢查結(jié)果顯示其病變并不明顯。實驗中剖檢的6只臨床急性犬瘟熱病犬全部出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀包括：抽搐、后肢癱瘓和共濟失調(diào)等，但是組織病理學觀察結(jié)果顯示大腦只出現(xiàn)了輕微的血管套和噬神經(jīng)現(xiàn)象，腦組織免疫組織化學實驗結(jié)果沒有觀察到免疫標記陽性的神經(jīng)細胞。國外實驗研究表明在急性和亞急性病例的感染，在犬的神經(jīng)系統(tǒng)中只有少量的炎性細胞浸潤，炎性損傷很少。所以急性病例中，大腦并不是最好的犬瘟熱病毒分離材料。

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