王春民　劉強　李建　徐波　米凱　程娟

摘要建立了二甲基甲酰胺（N，Ndimethyl formamide，DMF）職業(yè)接觸者血紅蛋白中N甲基氨甲酰加合物超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC/MS/MS）快速檢測方法。準確稱取0.1 g 血紅蛋白樣品置于15 mL離心管中，加入40 μmol/L 3甲基異丁基海因（3methy5isobutylhydantion，MIH）內(nèi)標溶液250 μL，再加入HCl醋酸（2∶1， V/V）溶液4.75 mL，振蕩混勻3 min。將試管置于沸水浴中加熱降解1 h，取出冷卻。混勻后取200 μL到96孔板，加入600 μL1%甲酸乙腈溶液，混勻。控制真空泵壓力，使樣品在2～4 min流出。將凈化后樣品混勻轉(zhuǎn)移到樣品瓶，用UPLC/MS/MS檢測N甲基氨甲酰加合物的降解產(chǎn)物3甲基異丙基乙內(nèi)酸脲（3Methyl5isopropylhydantoin， MVH）。質(zhì)譜采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式，內(nèi)標法定量。結(jié)果表明，MVH濃度在0.01～1.0 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999。空白人群血紅蛋白MVH加標回收率為97.3%，相對標準偏差為1.7%，血紅蛋白中MVH檢出限為0.01 μmol/g。本方法能很好地應(yīng)用于二甲基甲酰胺職業(yè)接觸者血紅蛋白中新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物的快速、準確測定。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜質(zhì)譜； 二甲基甲酰胺； N甲基氨甲酰加合物； 3甲基異丙基乙內(nèi)酸脲； 生物標志物

1引言

N，N二甲基甲酰胺（N，Ndimethyl formamide， DMF），簡稱二甲基甲酰胺，是一種透明液體，能與水及大部分有機溶劑互溶，因其具有很強的溶解能力，又被稱為“萬能有機溶劑”，它是化學(xué)反應(yīng)的常用溶劑＼[1＼]。作業(yè)場所DMF主要經(jīng)呼吸道及皮膚進入機體，對肺臟、肝臟及腎臟等器官造成損害，嚴重者可導(dǎo)致死亡＼[2，3＼]。DMF已經(jīng)成為我國工業(yè)中毒中常見的毒物之一。開展DMF生物標志物研究，尤其是接觸標志物研究，對于預(yù)防和控制作業(yè)場所DMF中毒，保護勞動者的健康具有重要意義。近年來，越來越多的研究表明，DMF體內(nèi)代謝產(chǎn)物異氰酸甲酯（Methylisocyanate，MIC）與血紅蛋白相互作用形成的加合物N甲基氨甲酰加合物（Nmethylcarbamoyl adduct）可作為反映DMF職業(yè)暴露水平的生物標志物＼[4～9＼]。由于人體血液紅細胞更新時間長達4個月，加合物一旦形成，在較長的時間內(nèi)可維持相對穩(wěn)定的水平。目前，關(guān)于血液中N甲基氨甲酰加合物的檢測，可通過埃德曼降解法，將加合物降解為3甲基異丙基乙內(nèi)酸脲（3Methyl5isopropylhydantoin，MVH），運用氣相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜法進行測定＼[9，10＼]。超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于二甲基甲酰胺職業(yè)接觸者血紅蛋白中新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物檢測尚未有報道，本研究建立了DMF新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物的測定方法，具有快速、高通量等優(yōu)點。DMF職業(yè)暴露人群血紅蛋白經(jīng)埃德曼降解后生成MVH，用96孔板快速凈化，超高效液相色譜質(zhì)譜檢測，以3甲基異丁基海因（3Methy5isobutylhydantion，MIH）為內(nèi)標進行定量分析。DMF體內(nèi)代謝及N甲基氨甲酰加合物埃德曼降解成MVH過程如圖1所示。

[TS（]圖1N，N二甲基甲酰胺代謝并降解成3甲基異丙基乙內(nèi)酸脲

Fig.1Schemesfor the metabolization and degradation of N，Ndimethyl formamide （DMF） to 3methyl5isopropylhydantoin （MVH）[HT5][TS）]

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UPLCQuattro Micro超高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；Multi Reax振蕩器（德國 Heidolph公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；V700真空泵，V855真空控制系統(tǒng)（瑞士Buchi公司）；Ostro 25 mg 96孔提取板，2 mL 96孔收集板，聚丙烯96孔板蓋墊，96孔板真空提取裝置（美國Waters公司）。

HCl（優(yōu)級純）、冰醋酸（分析純）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純）、MVH標準品（湖南化工研究院提供）、MIH標準品（湖南化工研究院提供），實驗用水為超純水。

2.2血紅蛋白制備

用肝素抗凝的采血管收集血樣5 mL，離心15 min，棄去血漿；用生理鹽水洗紅細胞兩次，然后用1 mL蒸餾水在超聲狀態(tài)下裂解紅細胞；緩慢加入15 mL預(yù)冷丙酮溶液（含有2% HCl）；沉降蛋白離心5 min，棄去上清液，再用15 mL上述丙酮溶液清洗3次，最后用15 mL乙酸乙酯清洗，剩余物以氮氣吹干。樣品采集后及時處理成血紅蛋白備用。

2.3樣品處理

準確稱取約0.1 g 血紅蛋白置于15 mL離心管中，加入40 μmol/L MIH內(nèi)標溶液250 μL，再加入鹽酸醋酸（2∶1， V/V）溶液4.75 mL，振蕩混勻3 min。將試管置于沸水浴中加熱降解1 h（反應(yīng)過程可能會產(chǎn)生氣泡，小心操作），取出冷卻?；靹蚝笕?00 μL到96孔板，加入600 μL 1%甲酸乙腈溶液，混勻?？刂普婵毡脡毫?，使樣品在2～4 min流出。將凈化后樣品混勻轉(zhuǎn)移到樣品瓶中待測。

2.4標準溶液配制

2.5色譜質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸（A）和乙腈（B），流速0.25 mL/min，柱溫35 ℃。采用梯度洗脫：0～3 min，90%～10% A；3～3.2 min，10% A；3.2～3.5 min，10%～90% A；3.5～4.0 min，90% A。進樣量5 μL。

采用ES+電噴霧電離源模式，毛細管電壓3.5 kV；萃取錐孔電壓3.0 V；源溫度120 ℃；脫溶劑溫度380 ℃；脫溶劑氣流速800 L/h；四極桿低（高）端分辨率13.0；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）。

3結(jié)果與討論

3.1前處理過程

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測時樣品前處理過程采用酸降解、調(diào)節(jié)酸度、乙酸乙酯提取靜置過夜、氮吹、定容等多個步驟，方法耗時長，前處理復(fù)雜＼[10＼]。為快速進行血紅蛋白中MVH檢測，前處理方法必須簡單有效。用96孔板進行實驗，將待測樣品取樣后加入內(nèi)標并進行酸降解，取200 μL降解液到96孔板，加入600 μL 1%甲酸乙腈混勻后減壓過板，收集濾出液并轉(zhuǎn)移到樣品瓶中待測。此法步驟少，可同時處理96個樣品，提高了樣品通量，符合快速檢測要求。

DMF在人體內(nèi)經(jīng)過代謝形成中間產(chǎn)物，此時血紅蛋白必須通過埃德曼降解法產(chǎn)生MVH，即沸水浴酸降解為必要步驟。比較酸降解后溶液和進一步調(diào)節(jié)pH值后， 溶液用96孔板處理，峰面積差異不大，但是經(jīng)過酸度調(diào)節(jié)的樣品過板后會析出沉淀，易堵住進樣針和流路系統(tǒng)，故酸降解后不調(diào)節(jié)酸度較好。在此情況下，上樣200 μL到96孔板，比較加入600 μL 1%甲酸乙腈和600 μL 5%氨化甲醇的降解效果，結(jié)果顯示，

3.296孔板與固相萃取柱的比較

采用HLB固相萃取柱處理經(jīng)埃德曼降解后的樣品，洗脫液直接進入LC/MS/MS分析，并與經(jīng)96孔板處理樣品比較，樣品圖譜無明顯差異。但檢測大量樣品時，過HLB固相萃取柱步驟復(fù)雜、耗時長、通量小、成本高，故選擇96孔板進行樣品凈化。

3.3基質(zhì)效應(yīng)和內(nèi)標法

降解后的血紅蛋白基質(zhì)復(fù)雜，經(jīng)過凈化去除磷脂蛋白等雜質(zhì)，但進樣后有離子抑制效應(yīng)，且目標物降低顯著。在相同條件下，連續(xù)進樣（n=6），比較同濃度標準溶液與在空白人群基質(zhì)加標并前處理的溶液。同樣濃度不同基質(zhì)的離子抑制情況如圖2所示，離子抑制效應(yīng)使得外標法不能準確定量，應(yīng)選擇內(nèi)標法。由于MVH由MIC與纈氨酸合成，MIH由MIC與異亮氨酸合成，兩者結(jié)構(gòu)類似，物理化學(xué)性質(zhì)接近，符合內(nèi)標物的選擇條件，故選擇MIH作為MVH內(nèi)標。

3.7樣品測定

采集某企業(yè)DMF職業(yè)暴露人群血液樣品441份，將血液樣品按照2.2節(jié)及時制備成符合要求的血紅蛋白，備用。將血紅蛋白按照本法用96孔板前處理并以超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，結(jié)果表明，對照人群血紅蛋白樣品中MVH均未檢出。職業(yè)暴露人群根據(jù)崗位不同，在DMF中暴露程度不同，血紅蛋白中MVH含量在0.01～0.18 μmol/g范圍內(nèi)，結(jié)果分布情況如圖4所示。空白對照人群和DMF職業(yè)暴露人群新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物降解產(chǎn)物MVH檢測對比如圖5所示。

4結(jié)論

通過96孔板凈化，超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速檢測DMF職業(yè)暴露人群血紅蛋白中新型生物標志物，取樣后前處理只需2 h左右，單個進樣運行只需4 min。與已報道的方法相比，本方法方便快速，通量高，在進行大批量樣品分析時，能準確及時檢測，可以節(jié)省大量時間和人力財力。 本方法能準確、快速測定DMF職業(yè)接觸者血紅蛋白中新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物。

References

1YANG Hua. Shanghai Chemical Industry， 2005， 30（6）： 44-46

楊 華. 上?；?， 2005， 30（6）： 44-46

2GU YongSheng. Journal of Occupational Health and Damage， 2009， 24（3）： 181-182

顧永生. 職業(yè)衛(wèi)生與病傷， 2009， 24（3）： 181-182

3LIU Quan， DU Fei， TAN Liang， WANG BoWei， ZHOU YiWu. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2009， 24（1）： 60-61

劉 泉， 杜 飛， 譚 亮， 王博維， 周亦武. 中國法醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 24（1）： 60-61

4Ramachandran P K， Gandhe B R， Venkateswaran K S， Kaushik M P， Vijayaraghavan R， Agarwal G S， Gopalan N， Suryanarayana M V S， Shinde S K. J. Chromatogr. B， 1988， 426（2）： 239-247

5Angerer J， Gen T， Krmer A， Kfferlein H U. Arch. Toxicol.， 1998， 72（5）： 309-313

6Kfferlein H U， Angerer J. Chem. Res. Toxicol.， 2001， 14（7）： 833-840

7Kfferlein H U， Ferstl C， BurkhartReichl A， Hennebrüder K， Drexler H， Brüning T， Angerer J. Occup. Environ. Med.， 2005， 62（5）： 330-336

8Mrz J， Duskov S， Glov E， Nohov H， Brabec M. Int. Arch. Occup. Environ. Health， 2002， 75 Supp： S93-6

9Mrz J， Duskov S， Glov E， Nohov H， Krausov P， Linhart I， Simek P. J. Chromatogr. B， 2002， 778（12）： 357-365

10WANG ChunMin， LIU Qiang， LI Jian， YAO JianHua， MI Kai， XU Bo， HUANG Lu. Industrial Health and Occupational Diseases， 2011， 37（6）： 381-383

王春民， 劉 強， 李 建， 姚建華， 米 凱， 徐 波， 黃 路. 工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病， 2011， 37（6）： 381-383

AbstractA rapid analytical method was developed for the determination of Nmethylcarbamoyl adduct in Hemoglobin of workers exposed to N，Ndimethylformamide by ultra high performance liquid chromatographymass spectrometry （UPLC/MS/MS）. About 0.1 g of hemoglobin sample， 40 μmol/L of 3methyl5isopropylhydantoin （MIH） as the internal standard and 4.75 mL of HClacetic acid （2∶1， V/V） were added in the centrifuge tube， and mixed for 3 min. Then the tube was heated in boiling water bath for 1h. After cooling down， 200 μL of the mixture and 600 μL of formic acidacetonitrile （1%） were added into 96well extract plate. The vacuum pump pressure was controlled to make the sample collection elute within 2-4 min. The purified collection was transferred into the sample vial， and 3methyl5isopropylhydantoin （MVH） as degration product of Nmethylcarbamoyl adduct was quantified by UPLC/MS/MS in multiple reaction monitoring （MRM） by internal standard method. A good linear relationship was obtained in the MVH concentration range of 0.01-1.0 μmol/L with the correlation coefficient of 0.999. The recovery of added MVH in the blank sample was 97.3% and the relative standard deviation was 1.7%. The limit of detection （LOD） was 0.01 μmol/g. This method was proved to be fast and efficient.

KeywordsUltra high performance liquid chromatographymass spectrometry； N，NDimethylformamide； NMethylcarbamoyl adduct； 3Methyl5isopropylhydantoin； Biomarker

10WANG ChunMin， LIU Qiang， LI Jian， YAO JianHua， MI Kai， XU Bo， HUANG Lu. Industrial Health and Occupational Diseases， 2011， 37（6）： 381-383

王春民， 劉 強， 李 建， 姚建華， 米 凱， 徐 波， 黃 路. 工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病， 2011， 37（6）： 381-383

AbstractA rapid analytical method was developed for the determination of Nmethylcarbamoyl adduct in Hemoglobin of workers exposed to N，Ndimethylformamide by ultra high performance liquid chromatographymass spectrometry （UPLC/MS/MS）. About 0.1 g of hemoglobin sample， 40 μmol/L of 3methyl5isopropylhydantoin （MIH） as the internal standard and 4.75 mL of HClacetic acid （2∶1， V/V） were added in the centrifuge tube， and mixed for 3 min. Then the tube was heated in boiling water bath for 1h. After cooling down， 200 μL of the mixture and 600 μL of formic acidacetonitrile （1%） were added into 96well extract plate. The vacuum pump pressure was controlled to make the sample collection elute within 2-4 min. The purified collection was transferred into the sample vial， and 3methyl5isopropylhydantoin （MVH） as degration product of Nmethylcarbamoyl adduct was quantified by UPLC/MS/MS in multiple reaction monitoring （MRM） by internal standard method. A good linear relationship was obtained in the MVH concentration range of 0.01-1.0 μmol/L with the correlation coefficient of 0.999. The recovery of added MVH in the blank sample was 97.3% and the relative standard deviation was 1.7%. The limit of detection （LOD） was 0.01 μmol/g. This method was proved to be fast and efficient.

KeywordsUltra high performance liquid chromatographymass spectrometry； N，NDimethylformamide； NMethylcarbamoyl adduct； 3Methyl5isopropylhydantoin； Biomarker

10WANG ChunMin， LIU Qiang， LI Jian， YAO JianHua， MI Kai， XU Bo， HUANG Lu. Industrial Health and Occupational Diseases， 2011， 37（6）： 381-383

王春民， 劉 強， 李 建， 姚建華， 米 凱， 徐 波， 黃 路. 工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病， 2011， 37（6）： 381-383

AbstractA rapid analytical method was developed for the determination of Nmethylcarbamoyl adduct in Hemoglobin of workers exposed to N，Ndimethylformamide by ultra high performance liquid chromatographymass spectrometry （UPLC/MS/MS）. About 0.1 g of hemoglobin sample， 40 μmol/L of 3methyl5isopropylhydantoin （MIH） as the internal standard and 4.75 mL of HClacetic acid （2∶1， V/V） were added in the centrifuge tube， and mixed for 3 min. Then the tube was heated in boiling water bath for 1h. After cooling down， 200 μL of the mixture and 600 μL of formic acidacetonitrile （1%） were added into 96well extract plate. The vacuum pump pressure was controlled to make the sample collection elute within 2-4 min. The purified collection was transferred into the sample vial， and 3methyl5isopropylhydantoin （MVH） as degration product of Nmethylcarbamoyl adduct was quantified by UPLC/MS/MS in multiple reaction monitoring （MRM） by internal standard method. A good linear relationship was obtained in the MVH concentration range of 0.01-1.0 μmol/L with the correlation coefficient of 0.999. The recovery of added MVH in the blank sample was 97.3% and the relative standard deviation was 1.7%. The limit of detection （LOD） was 0.01 μmol/g. This method was proved to be fast and efficient.

KeywordsUltra high performance liquid chromatographymass spectrometry； N，NDimethylformamide； NMethylcarbamoyl adduct； 3Methyl5isopropylhydantoin； Biomarker