郝其睿, 牟振波, 徐革峰, 劉 斌, 韓 英

(1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150000;3.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001)

興凱湖翹嘴鲌(Culteralburnus)LPL基因克隆及其表達

郝其睿1,2, 牟振波2, 徐革峰1, 劉 斌3, 韓 英1

(1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150000;3.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001)

采用RT-PCR和RACE技術，進行興凱湖翹嘴鲌LPL基因的克隆與表達分析，旨在為其脂肪性狀的研究奠定基礎.根據(jù)Genbank中已知的鯉科魚類LPL基因序列設計引物，克隆出興凱湖翹嘴鲌(Culteralburnus)脂蛋白酯酶(idella lipoprotein lipase，LPL)的cDNA序列；將其提交到Genbank，獲得基因登陸號為KC166 231；興凱湖翹嘴鲌LPL基因cDNA序列共1 947 bp,基因編碼區(qū)序列共1 524 bp，編碼一個終止密碼子和507個氨基酸；通過Blast與Genbank上發(fā)表的其他物種的CDS區(qū)進行比對發(fā)現(xiàn)，與草魚(Ctenopharyngodon)的同源性達到98%.采用熒光定量PCR(Real-time PCR)技術檢測了興凱湖翹嘴鲌野生群體和養(yǎng)殖群體在不同年齡、不同組織中LPL的表達量.結果表明，隨年齡的增長野生群體與養(yǎng)殖群體LPL基因相對表達量差異增大， 4齡養(yǎng)殖群體LPL基因相對表達量是同期野生群體的17.54倍，二者差異顯著(P<0.05)；LPL基因在心臟當中表達水平最高，脾和肝臟中的表達量次之.

興凱湖翹嘴鲌；LPL；基因克??；組織表達

興凱湖翹嘴鲌是翹嘴鲌的一個地理種群，其生長環(huán)境的興凱湖污染小、水質好、營養(yǎng)物質豐富，因而興凱湖翹嘴鲌肉色潔白、肉質細嫩、味道鮮美，蛋白質占魚體干物質含量達85.66%，脂肪占魚體干物質含量達20.02%[1]，成為魚中上品，具有非常高的經濟價值.由于過度捕撈導致自然資源匱乏，興凱湖翹嘴鲌養(yǎng)殖技術的研究已引起水產工作者的重視[2～4]，在人工養(yǎng)殖條件下，如何保持其原有的肉質風味，是養(yǎng)殖者必須解決的問題.肉質性狀多為數(shù)量性狀，由多基因控制，其中脂蛋白酯酶能夠催化與蛋白質相聯(lián)的甘油三脂的水解，在脂質轉運和代謝過程中存在重要作用.本研究對興凱湖翹嘴鲌LPL基因的克隆與表達進行了研究，為了解興凱湖翹嘴鲌脂肪性狀的形成與調控機制，以及魚類選種和育種奠定基礎.

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1 主要儀器 PTC-200 原位梯度PCR儀;ABI PRISM 7500熒光定量PCR儀;EPS-300A電泳儀.

1.1.2 主要試劑 Trans5α感受態(tài)細胞;EasyTaq DNA Polymerase;10×EasyTaq Buffer;Trans 2K DNA Marker.以上試劑購自北京全式金生物技術有限公司.TRIzol LS RNA Extraction Kit試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自?；锟萍加邢薰?5’-Full RACE Kit試劑盒、3’-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒、熒光定量試劑盒購自大連寶生物工程有限公司.

1.2試驗魚樣本采集

試驗魚樣采自黑龍江興凱湖，養(yǎng)殖群體來源于黑龍江農墾振達興凱湖大白魚研究基地，2齡質量為(142.1±6.3)g，4齡質量為(1 364.5±12.9)g，各10尾.使用180 ℃烘干無RNA酶處理的剪刀及手術刀解剖并采取鮮活魚體的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸、肌肉、脂肪和鰓，將各組織分別裝入使用DEPC(焦碳酸二乙酯)去RNA酶處理的Ep管中，迅速放入液氮中保存，隨后轉入-80 ℃冰箱中.

1.3興凱湖翹嘴鲌LPL基因的克隆

提取興凱湖翹嘴鲌肌肉組織RNA，使用紫外分光光度計以及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA.OD260/OD280在1.8～2.0之間，且凝膠成像顯示RNA在28 S，18 S，5 S處有3條帶.用3 μg的總RNA進行反轉錄，反應程序為：30 ℃，5 min；42 ℃，30 min；95 ℃，5 min；4 ℃.

根據(jù)鯉(CyprinuscarpioL.)的LPL基因序列，利用Primer 5.0軟件設計出2對引物(表1).以興凱湖翹嘴鲌肌肉組織總RNA為模板，擴增出部分cDNA序列，根據(jù)興凱湖翹嘴鲌LPL基因部分CDS區(qū)設計了RACE法擴增5'端和3'端所需的2對引物，分別為H5’out，H5’in和H3’out，H3’in.由此擴增出興凱湖翹嘴鲌LPL基因的完全cDNA序列.用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，回收目的條帶.將回收產物與PMD-18T載體連接，轉化后篩出陽性克隆.

1.4LPL基因mRNA的表達量檢測

從心、肝、脾、腎、腸、鰓、肌肉各組織中提取總RNA，進行反轉錄.使用Primer 5. 0軟件設計FQ-PCR的引物見表2.采用FQ-PCR檢測H-FABP基因在各組織中的相對表達量.PCR反應條件為95 ℃，15 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min.

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用NCBI上的BLAST功能，將克隆出來的序列與其它物種進行比對.使用DNAMAN軟件對克隆出來的cDNA序列進行拼接.使用MEGA4. 0軟件進行變異分析并構建鄰接發(fā)育樹.采用SPSS17.0軟件對表達量進行顯著檢驗.

2 結果與分析

2.1興凱湖翹嘴鲌LPL基因cDNA克隆及序列分析

興凱湖翹嘴鲌LPL基因cDNA序列共1 947 bp(圖1)，LPL基因編碼區(qū)序列共1 524 bp，編碼一個終止密碼子和507個氨基酸.將其提交到Genbank，獲得基因登錄號為KC166 231.

表1 興凱湖翹嘴鲌LPL基因克隆所用引物序列Table 1 Primers for the cloning of LPL gene in Culter alburnus in Xingkai Lake

表2 FQ-PCR引物Table 2 The primer of FQ-PCR

利用EXPASY數(shù)據(jù)庫中的PROSITE和NCBI的保守結構域數(shù)據(jù)庫，對興凱湖翹嘴鲌LPL氨基酸序列進行蛋白質保守結構功能域分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質的第356～478個氨基酸區(qū)域處存在PLAT纖維酶原激活物結構.將所得氨基酸序列提交至NCBI進行blast氨基酸同源性比對，結果表明,興凱湖翹嘴鲌LPL基因氨基酸序列與鯉科魚類草魚(Ctenopharyngodon)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)的同源性達到97%以上，與鯉、鯽(Carassiusauratus)等同源性為90%；與虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、鱸(Dicentrarchuslabrax)、羅非魚(Oreochromisniloticus)、鱖(Sinipercachuatsi)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等的同源性均在72%～75%.興凱湖翹嘴鲌LPL基因編碼的氨基酸數(shù)目與草魚、鰱、鯽和鯉數(shù)目相同，比東方紅鰭鲀少3個，比鱖少4個，比羅非魚、鱸、牙鲆少7個，比虹鱒多5個.

2.2興凱湖翹嘴鲌LPL的系統(tǒng)進化分析

使用Clustalx軟件將興凱湖翹嘴鲌LPL基因編碼的氨基酸序列與草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鯪(Cirrhinusmolitorella)、虹鱒、真鯛(Pagrusmajor)、鱸、褐菖鮋(Sebastiscusmarmoratus)、大黃魚(Larimichthyscrocea)、羅非魚、東方紅鰭鲀(Takifugurubripes)、鱖、點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、牙鲆、雞(Gallusgallus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、羊(Caprahircus)的LPL基因編碼的序列進行多重比較分析，使用MEGA4.0程序中的Neighbor-Joining和Maxinum Parsimony算法，設Bootstrap為1000，構建遺傳進化樹(圖2).觀察進化樹發(fā)現(xiàn)興凱湖翹嘴鲌與鰱和草魚歸類在一起，其次是鯉和鯽，再次是虹鱒，東方紅鰭鲀再次之，與其他魚類差異較大，魚類與鳥類和哺乳類差異較大，分布于2個分支上.

圖1 興凱湖翹嘴鲌LPL基因全cDNA序列Fig.1 The complete cDNA sequence of LPL gene of Culter alburnus in Xingkai Lake

圖2 NJ法構建興凱湖翹嘴鲌LPL氨基酸序列遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of LPL in culter alburnus in Xing kai Lake with NJ

2.3興凱湖翹嘴鲌LPL基因mRNA的相對表達量

2.3.1 在不同年齡肌肉組織的表達 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對2，4齡野生和養(yǎng)殖興凱湖翹嘴鲌LPL基因的表達量進行顯著性分析，數(shù)據(jù)顯示，2齡興凱湖翹嘴鲌野生群體與養(yǎng)殖群體肌肉LPL基因相對表達量無顯著差異(P<0.05)；而 4齡養(yǎng)殖群體LPL基因相對表達量維持在一個較高的水平，是同期野生翹嘴鲌的17.54倍，差異顯著(P<0.05)；2齡野生和養(yǎng)殖翹嘴鲌LPL基因相對表達量明顯低于4齡群體(P<0.05)(圖3、圖4).

圖3 2齡野生和養(yǎng)殖興凱湖翹嘴鲌LPL基因表達Fig.3 Expression of LPL gene of the wild and the culturedin Xingkai Lake of 2 years old

圖4 4齡野生和養(yǎng)殖興凱湖翹嘴鲌LPL基因表達Fig.4 Expression of LPL gene of the wild and the culturedin Xingkai Lake of 4 years old

2.3.2 在不同組織中的表達LPL基因在心臟中表達水平最高，脾和肝臟中的表達量次之，3者表達量均顯著高于其他組織(P<0.05)，腎、腸、鰓、肌肉組織中表達量較低，差異不顯著(P>0.05)(圖5).

圖5 興凱湖翹嘴鲌LPL基因在7個組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression of Sander lucioperca LPL gene in 7 tissues

3 討論與結論

3.1興凱湖翹嘴鲌LPL基因的克隆

本試驗根據(jù)已知鯉科魚類草魚的LPL基因序列設計引物，克隆得到翹嘴鲌LPL基因的一部分CDS區(qū)，使用普通PCR分段克隆剩余序列并采用RACE法獲得該基因的5’端和3’端，拼接后獲得完全CDS區(qū)序列(1 524 bp)，以及5’UTR(159 bp)區(qū)和部分的3’UTR區(qū)(423bp)組成的共1947bp的基因組序列.序列分析顯示興凱湖翹嘴鲌LPL基因與草魚、鰱、鳙和鯉等魚類的結構相同，蛋白結構功能域分析結果顯示，在cDNA編碼區(qū)的1068～1434個堿基區(qū)域編碼一個PLAT纖維酶原激活物結構.PLAT是一種特異性絲氨酸蛋白酶，可以將無活性的纖溶酶原轉化有活性的纖溶酶.該結構對調控LPL蛋白的活性起關鍵作用.

3.2興凱湖翹嘴鲌LPL基因的表達分析

3.2.1 在各組織中的表達分析 楊恒東等[5]在興義矮腳雞的腹脂、皮脂、肝、肌肉中檢測到LPL基因的表達.在魚類中，梁旭方等[6]在真鯛的肝臟以及腹腔腸系膜脂肪組織中檢測到LPL基因的表達[6]；姚煜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，LPL基因在鱖的脂肪組織中表達量最多，在肝臟中表現(xiàn)中等表達水平，在腦、腸道、肌肉，尤其是在脾中表達量偏低[7]，這與SAERA-VILA[8]對金頭鯛的研究結果相符.有研究表明，LPL基因在草魚的肌肉、肝、鰓、心臟、腹腔脂肪組織中均有不同程度的表達，但在腹腔脂肪組織中表達水平最高，其次是心臟組織，在鰓中表達水平最低[9].本研究對興凱湖翹嘴鲌7個組織的LPL基因mRNA相對表達量進行比較，發(fā)現(xiàn)該基因在心臟中表達量最高，在肝、脾、肌肉、鰓中均有中度表達，在腎和腸中僅有微量表達，這一結果與草魚的研究有一定差異.LPL是一種由實質細胞的粗面內質網合成的蛋白質，廣泛分布于各組織，通過蛋白聚糖鏈錨定在血管內皮表面，經肝素作用后釋放到血液中，在apoB 作用下，LPL呈活化狀態(tài).血漿中呈活化狀態(tài)的LPL主要分布在富含TG的脂蛋白中[10].

3.2.2 在不同年齡組肌肉組織中的表達分析 脂蛋白脂酶是對與蛋白質相聯(lián)的甘油三脂的水解有催化作用的蛋白水解酶，在脂質轉運和代謝過程中存在重要作用，可將血液中的乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的TG水解成甘油和脂肪酸，供各組織貯存利用[11].因此，LPL基因的表達量與肌內脂肪含量有相關性.王琨等[12]研究發(fā)現(xiàn)，興凱湖翹嘴鲌野生群體血液血糖、TG和膽固醇含量顯著低于養(yǎng)殖群體，而高密度脂蛋白膽固醇的含量顯著高于養(yǎng)殖群體，隨年齡增長，肌內脂肪、TG和膽固醇含量均有升高趨勢；野生群體的肌內脂肪含量顯著低于養(yǎng)殖群體，并隨年齡增長差異增大[12].本研究結果顯示，2 齡野生群體與養(yǎng)殖群體肌肉LPL的相對表達量差異不顯著，在4齡養(yǎng)殖群體養(yǎng)殖群體是野生群體的15倍多，顯著高于野生群體的表達量.研究初步結果表明，野生群體與養(yǎng)殖群體LPL基因的表達與肌內脂肪含量在一定程度上呈現(xiàn)了正相關.LPL是個短壽命的酶，其活性受LPLmRNA水平的快速調節(jié)[13,14].由于LPL轉錄后水平的調控主要通過影響mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率以及翻譯后修飾來實現(xiàn)，飲食狀態(tài)和生理性調節(jié)因子均在轉錄及轉錄后水平影響LPL的合成[15].ONG 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，體形瘦的人進食后LPL活性可升高2.2倍，而體形胖的人卻無明顯變化，但其單位脂肪中LPL水平較高，未發(fā)現(xiàn)mRNA水平變化，并且發(fā)現(xiàn)長期使用胰島素也可增加脂肪細胞LPLmRNA的穩(wěn)定性.這提示通過調節(jié)LPL翻譯效率，可影響LPL的合成.LPL基因的表達亦受諸多因素的影響，如溫度、激素、食物組成等.PRDAINES等[17]研究發(fā)現(xiàn)，生長激素能誘導LPL的表達，并能穩(wěn)定mRNA的水平，使酶活性提高5倍.肉質性狀多為數(shù)量性狀，由多基因控制，LPL基因雖然是肌內脂肪沉積的重要參與者，但是由于肌內脂肪含量受諸多因素的影響，如營養(yǎng)狀態(tài)、生理周期等，2者的相關性還需深入的研究，如LPL是否存在與如肝酯酶、內皮脂酶和胰脂酶等其他酯酶的互作等，也可以嘗試從激素角度研究2者之間的關系.

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(責任編輯：梁保松)

CloningandexpressionofLPLgeneofCulteralburnusinXingkaiLake

HAO Qi-rui1,2, MU Zhen-bo2, XU Ge-feng1, LIU Bin3， HAN Ying1
(1.Northeast Agricultural University, National-local United Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding, Harbin 150030, China; 2.Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Harbin 150000, China; 3.Guangdong Medical College Affiliated Hospital, Zhanjiang 524001, China)

In order to lay a foundation for the study of the characters of its fat, we carryed out the cloning of theLPLgene ofCulteralburnusin Xingkai Lake and analyzed its expression using RT- PCR and RACE technology. According to the knownLPLgene sequence designed primers of cyprinid fish in the Genbank, We cloned cDNA sequence of idella lipoprotein lipase ofCulteralburnusand submitted it to the Genbank, getting Genbank accession no KC166 231. There were 1 947 bp cDNA sequences of theLPLgene ofCulteralburnusin Xingkai Lake and 1 524 bp coding sequences. We coded one termination codon and 507 amino acid. By comparing Blast with other species’ CDS region published in the Genbank, we found its homology withCtenopharyngodonreached 98%. We detectedLPLexpression quantity at different ages and in different tissues of cultured and wild populations ofCulteralburnusin Xingkai Lake by using Real- time PCR and the results showed that, the differences of relative expression ofLPLgene were advanced with the growth of age of cultured and wild populations. The relative expression ofLPLgene of cultured population at age four was 17.54 times of the homochronous wild population and they were diversity markedness (P<0.05). The expression level ofLPLgene in heart was the highest, which of spleen and liver took the second place.

Culteralburnusin Xingkai lake;LPL; gene cloning; tissues expression

1000-2340(2014)06-0741-05

S 767.5

：A

2014-06-20

黑龍江省自然科學基金項目(AC200934);黑龍江博士后資助項目(LRB10-633)

郝其睿，1987年生，男， 黑龍江賓縣人，碩士，主要從事漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測和研究.

韓 英，1963年生，女，黑龍江雞東人，教授，博士研究生導師.