沛縣鴨傳染性漿膜炎的病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

摘要：收集沛縣具有典型鴨傳染性漿膜炎癥狀的34份病死鴨進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，總共得到18株疑似鴨疫里默氏桿菌（RA），從中隨機(jī)選取10株RA進(jìn)行生化鑒定及動(dòng)物回歸試驗(yàn)，經(jīng)確認(rèn)后使用本地區(qū)常見的抗菌藥進(jìn)行了紙片法藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA分離菌株對(duì)頭孢噻肟、氧氟沙星、阿莫西林+棒酸等藥物敏感度較好，對(duì)氟苯尼考、丁胺卡那、阿奇霉素等藥物敏感度很低。研究結(jié)果為該地區(qū)鴨傳染性漿膜炎的藥物防治提供了很好的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鴨傳染性漿膜炎；鴨疫里默氏桿菌（RA）；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

沛縣作為我國(guó)生態(tài)肉鴨養(yǎng)殖第一縣，伴隨著規(guī)模的迅速擴(kuò)增，以鴨傳染性漿膜炎為代表的肉鴨疾病在該地區(qū)的發(fā)生也越來越常見，已成為目前嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)仞B(yǎng)鴨業(yè)的因素之一。鴨傳染性漿膜炎的病原體為鴨疫里默氏桿菌（RA），其血清型眾多，相互間基本無交叉免疫保護(hù)作用，再加上用藥的不合理，很容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致了當(dāng)?shù)豏A的耐藥性日益嚴(yán)重，限制了本地區(qū)對(duì)鴨疫里默氏桿菌病的防治效果，從而給本地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)利用走訪調(diào)研機(jī)會(huì)，對(duì)沛縣RA進(jìn)行了病原分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，以期了解該地區(qū)RA的耐藥情況，從而為該地區(qū)藥物防治鴨傳染性漿膜炎提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來源于2013年7至11月份徐州市沛縣的具有典型鴨傳染性漿膜炎病變的病死鴨，共34份，其中死鴨16份，病鴨18份。品種都為櫻桃谷，日齡為16～38d，分別來自于沛縣的鹿樓、朱寨、大屯和大沙河等肉鴨養(yǎng)殖較集中的4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)。

1.1.2 材料 試驗(yàn)選用的普通瓊脂、胰酪胨大豆瓊脂、血瓊脂、麥康凱瓊脂等培養(yǎng)基均為單位實(shí)驗(yàn)室自配。腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司。藥敏試紙購自上海生物化學(xué)試劑公司，選用本地區(qū)養(yǎng)鴨生產(chǎn)中常用的12種藥物。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡櫻桃谷雛鴨購自沛縣森磊農(nóng)產(chǎn)品發(fā)展有限公司，飼養(yǎng)管理于某家庭肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)，15日齡后健康者供動(dòng)物回歸試驗(yàn)使用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與鏡檢 參照文獻(xiàn)[1]方法操作。無菌采樣病死鴨心與肝臟，分別接種于普通瓊脂、胰酪胨大豆瓊脂、血瓊脂、麥康凱瓊脂等培養(yǎng)基各2塊，一組置于蠟燭缸內(nèi)，連同另一組同在37℃溫箱培養(yǎng)48h。挑選胰酪胨和血瓊脂培養(yǎng)基上的可疑菌落作純化培養(yǎng)后保存，同時(shí)在普通瓊脂和麥康凱平板接種上述可疑菌落培養(yǎng)并觀察其生長(zhǎng)與否。最后將純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落涂于干凈的載玻片上，按常規(guī)方法分別進(jìn)行瑞氏與革蘭氏染色并鏡檢，觀察其形態(tài)特征。

1.2.2 生化試驗(yàn) 取分離菌株的純培養(yǎng)物分別做吲哚、M.R.、V-P、枸櫞酸鹽試驗(yàn)、明膠液化、硫化氫、尿素酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)。37℃恒溫箱培養(yǎng)，連續(xù)觀察7d。具體操作參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。

1.2.3 回歸試驗(yàn) 隨機(jī)從18株細(xì)菌中選取10株按文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行。首先刮取純化培養(yǎng)的菌株制成生理鹽水細(xì)菌懸浮液，再按0.5ml/只皮下接種18日齡肉鴨腿部，同時(shí)設(shè)立滅菌生理鹽水對(duì)照組。接種后每日觀察記錄鴨的精神、飲食、糞便、運(yùn)動(dòng)及死亡情況，并對(duì)死亡鴨進(jìn)行病理剖檢，取死鴨的心血、肝組織按上述方法進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法，對(duì)確定為RA的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將所分離出的所有菌株分別均勻劃線接種在血液瓊脂平板上，置37℃燭缸中培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果抑菌圈直徑。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：直徑小于10mm為不敏感，10～15mm為中敏，15mm及以上為高敏。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 通過培養(yǎng)從上述采集的病料中分離到的18株疑似RA，其在厭氧條件下的胰酪胨和血瓊脂平板上，均可長(zhǎng)出直徑1～2mm的微隆起菌落，呈光滑、圓形、奶油狀，而在麥康凱、普通瓊脂平板上不生長(zhǎng)。

2.2 染色鑒定 對(duì)分離到的細(xì)菌涂片并經(jīng)瑞氏染色、鏡檢，可見兩極濃染、兩端鈍圓的小桿菌；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢均可見陰性、無芽孢的小桿菌，以單個(gè)、成對(duì)或單鏈狀存在。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果 18株分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果完全一致，菌株對(duì)麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖以及乳糖等均不發(fā)酵，吲哚、M.R.、V-P、枸櫞酸鹽利用及硫化氫試驗(yàn)皆呈陰性，液化明膠、尿素酶試驗(yàn)和過氧化氫酶試驗(yàn)呈陽性。

2.4 回歸試驗(yàn)結(jié)果 健康的18日齡雛鴨在接種細(xì)菌后，22～86h內(nèi)全部出現(xiàn)精神沉郁、縮頸、不能站立、眼鼻有分泌物等癥狀，并陸續(xù)出現(xiàn)死亡。對(duì)病死鴨剖檢發(fā)現(xiàn)心包、肝臟、氣囊均覆蓋有大量灰白色纖維素性滲出物，部分脾臟腫大，其癥狀與自然感染鴨相似。再取心血和肝組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)并作鏡檢，形態(tài)特征與接種菌株完全一致。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 從藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表1）可見，10株RA分離菌株對(duì)阿莫西林+棒酸敏感率為90%，氧氟沙星、頭孢噻肟都為80%，利福平則為70%，對(duì)氟苯尼考、丁胺卡那、阿奇霉素等藥物則表現(xiàn)出嚴(yán)重的耐藥性，敏感率僅有20%。

3 小結(jié)與討論

沛縣是我國(guó)肉鴨養(yǎng)殖比較集中的地區(qū)，由于養(yǎng)殖規(guī)模大、管理技術(shù)相對(duì)缺失，也是各種鴨病常發(fā)流行地區(qū)。課題組在項(xiàng)目實(shí)施過程中，從5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)共13個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)（戶）的34例具有典型“三炎”癥狀的病死鴨體內(nèi)都分離到細(xì)菌，經(jīng)臨床檢查與實(shí)驗(yàn)室鑒定，確定18株為RA，5個(gè)地區(qū)幾乎所有養(yǎng)鴨場(chǎng)均有檢出，這也說明鴨傳染性漿膜炎這一肉鴨常見病目前在徐州地區(qū)大范圍流行。

鴨傳染性漿膜炎的發(fā)病原因多樣而復(fù)雜，但是當(dāng)前防治該病的主要方法還是使用抗生素，針對(duì)各種類抗生素的防治效果隨流行菌株耐藥性的影響而不盡相同，非常有必要對(duì)不同地區(qū)乃至不同鴨場(chǎng)開展RA流行菌株的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)，從而根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用高敏抗生素，以取得良好的治療效果，最終降低疾病對(duì)肉鴨養(yǎng)殖效益的影響。

本文僅對(duì)沛縣的鴨傳染性漿膜炎的病原部分進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，從試驗(yàn)結(jié)果來看，當(dāng)?shù)豏A分離菌株對(duì)利福平、頭孢噻肟、氧氟沙星、阿莫西林+棒酸等藥物的敏感率很高，而對(duì)氟苯尼考、丁胺卡那、阿奇霉素、紅霉素、慶大霉素等5種藥物的敏感率都在30%以下，由此可見，在本地區(qū)RA對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性。據(jù)2011年陳永亮等報(bào)道[3]，徐州地區(qū)分離株對(duì)磷霉素、阿莫西林+棒酸、氧氟沙星等敏感性較高，本研究從徐州所轄沛縣近期分離的10株RA對(duì)上述后兩種藥物的敏感率分別為90%和80%，敏感率依舊很高，但中度敏感比例有所增加，這應(yīng)該引起我們的注意。

隨著本地區(qū)RA耐藥菌株的逐漸增多，各種抗生素對(duì)鴨傳染性漿膜炎的防治效果可能會(huì)逐年走低，且大量使用抗生素會(huì)導(dǎo)致藥物殘留，既影響鴨肉產(chǎn)品的質(zhì)量，更威脅人類的健康。因此，建議本地區(qū)肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）應(yīng)該立即革新疾病防治觀念，采取綜合防治措施，選擇微生態(tài)制劑、中草藥等抗生素替代藥物，如此，方是防控鴨傳染性漿膜炎的發(fā)展方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] 汪銘書，程安春，陳孝躍，等.血清8型鴨疫里默氏桿菌在我國(guó)的發(fā)現(xiàn)及其病原特性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（1）：47-49.

[2] 韓文瑜，何昭陽，劉玉斌，等.病原細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)[M].吉林：吉林科技出版社，1992：305-308.

[3] 陳永亮，戚邦帥.徐州地區(qū)鴨疫里氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2012（3）：81-83.

Abstract： Eighteen strains of bacteria strains were isolated from thirty-four samples with serositis collected from Peixian. According to biochemical properties and animal inoculation test， ten strains were identified as Riemerella Anatipestifer（RA）. Antibiotic sensitivity of isolated strains were detected with local common kinds of antibiotics， and the results showed that these isolated strains were highly sensitive to Cefotaxime， Ofloxacin， Amoxicillin add clavulanic acid， and were not so sensitive to Florfenicol， Amikacin， Azithromycin. All results obtained from this study provided well foundation for the medicinal therapy of duck infectious serositis in Peixian.

Key words： duck infectious serositis； riemerella anatipestifer； isolation and identification； antibiotic sensitivity test