謝會(huì)雅，史端甫，張紅兵，羅真華，段伶俐，周真珍，楊莉穎，賀利雄

（1. 湖南省煙草公司 株洲市分公司，湖南 株洲 412000；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南 長(zhǎng)沙 410128）

煙草是原產(chǎn)于亞熱帶的喜溫作物，其生長(zhǎng)最適溫度為25～28℃，10～13℃停止生長(zhǎng)、1～2℃低溫可使幼苗死亡，環(huán)境溫度尤其是低溫對(duì)煙草的生育、產(chǎn)量和品質(zhì)都有明顯影響。在湘南、湘西北和湘中煙區(qū)低溫危害（即倒春寒）頻發(fā)，導(dǎo)致早春移栽后煙苗受害、大田前期生長(zhǎng)緩慢以及導(dǎo)致早花，嚴(yán)重引起煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的波動(dòng)，也一直制約優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的發(fā)展[1]，目前增強(qiáng)品種的低溫耐性已成為煙草品種改良的主要目標(biāo)之一。針對(duì)困擾煙草生產(chǎn)的“倒春寒”危害這一實(shí)際問(wèn)題，通過(guò)遺傳改良育成耐低溫新品種是解決“倒春寒”危害的根本性策略，但這耗時(shí)周期長(zhǎng)，且需要大量的人力、物力和財(cái)力。因此，通過(guò)農(nóng)藝措施如噴施煙草低溫耐性調(diào)節(jié)劑提高煙草幼株的低溫耐性，不失為及時(shí)應(yīng)對(duì)早春低溫危害的一種方法。

研究報(bào)道表明，多種外源化學(xué)物質(zhì)（生理活性物質(zhì)）如甜菜堿[2-3]、聚乙二醇[4]、水楊酸[4-5]、5-氨基乙酰丙酸[6-7]和ABA、氯化鈣、維生素C[8]等對(duì)植物的逆境抗性具有調(diào)節(jié)作用。本研究在低溫逆境脅迫條件下，對(duì)葉面噴施水楊酸、甜菜堿、聚乙二醇和5-氨基乙酰丙酸煙草植株的抗寒性相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)分析，評(píng)價(jià)其改善煙草低溫抗性的生理效果，以期為煙草苗期低溫耐性調(diào)節(jié)劑有效組分的篩選提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)材料

參試煙草品種為K326、由中國(guó)煙草中南試驗(yàn)站提供，采用煙草育苗專用基質(zhì)和漂浮育苗法，依照煙草育苗技術(shù)進(jìn)行肥水管理；出苗后1～2 片真葉期間苗、3～4片真葉期移植盆栽，幼苗至6～7 片真葉時(shí)（苗齡約55 d 左右)，選用生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗供試驗(yàn)用。

1.2 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理方法

選用與植物低溫逆境抗性關(guān)系密切的水楊酸（SA）、甜菜堿（GB）、聚乙二醇（PEG 6000）和5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）4種生理活性物質(zhì)（以清水為對(duì)照），葉面噴施濃度分別為（輔以0.1%Tween 20）：10 mg/L、15 mmol/L、2.5 mmol/L 和10%。

將供試煙苗移入人工氣候室常溫馴化3 d 后（22～25℃，5 000 lx、光照12 h），整株噴施生理活性物質(zhì)溶液，以葉片上下表面濕透為度、噴施處理15 株；噴施處理24 h 后，開(kāi)始低溫逆境處理。

于2013～2014年用人工氣候室(AGC-D003N，浙江求是人工環(huán)境有限公司)模擬“倒春寒”時(shí)期氣候條件實(shí)施低溫逆境脅迫處理（6～7℃，1 000 lx、光照12 h），期間正常水分管理。低溫逆境處理第0、1、3、5、7 d，光照6 h后，選取中位成熟葉片進(jìn)行葉片相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定，重復(fù)5次，并採(cǎi)集各處理鮮葉樣品液氮冷凍、研碎，-80℃超低溫冰箱保存，供后續(xù)理化分析用；用Excel 2010 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3 葉片生理指標(biāo)檢測(cè)方法

生理指標(biāo)定量分析檢測(cè)依照《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[9]和《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》方法[10]、或略加改良后進(jìn)行（重復(fù)3 次），比色法使用SP-752 紫外分光光度計(jì)(上海光譜)。檢測(cè)方法：（1）相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定使用DDS-307 電導(dǎo)儀(上海雷磁）測(cè)定葉片組織外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率；（2）葉綠素含量測(cè)定采用80%丙酮提取比色法；（3）可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法；（4）游離脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮比色法；（5）過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法；（6）丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理活性物質(zhì)處理對(duì)煙草葉片細(xì)胞膜相對(duì)電導(dǎo)率的影響

當(dāng)植物遭遇逆境脅迫時(shí)，半透性的細(xì)胞膜既是感受逆境脅迫的最敏感部位，也是細(xì)胞首先被“傷害”的部位，由于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)“受損”導(dǎo)致其透性增大、細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)和電解質(zhì)會(huì)被動(dòng)地向膜外滲漏，細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率的增大反映了質(zhì)膜的傷害程度[11]。

從圖1 可見(jiàn)，與低溫處理前（0 d）相比，低溫處理第1、3、5、7 d、對(duì)照的相對(duì)電導(dǎo)率分別增加44.82%、75.30%、102.70%和117.72%，而4種生理活性物質(zhì)處理的電導(dǎo)率增長(zhǎng)幅度均低于對(duì)照，分別為11.06%～23.25%、31.51%～47.91%、50.60%～59.45%和60.43%～73.03%。說(shuō)明4種生理活性物質(zhì)能減輕低溫脅迫下煙草葉片受到的傷害、減少細(xì)胞溶質(zhì)的外滲，對(duì)煙草細(xì)胞膜具有良好的保護(hù)作用，且4種生理活性物質(zhì)中，5-ALA、SA 及GB 的效果優(yōu)于PEG。

圖1 生理活性物質(zhì)處理煙草葉片細(xì)胞膜相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.2 生理活性物質(zhì)處理對(duì)煙草植株可溶性糖、游離脯氨酸含量的影響

當(dāng)遭遇逆境脅迫時(shí)，植物會(huì)主動(dòng)調(diào)整自身代謝、強(qiáng)化專一的生理代謝，積累可溶性糖、脯氨酸和甜菜堿等相溶性溶質(zhì)來(lái)提高細(xì)胞液濃度、降低細(xì)胞水勢(shì)和冰點(diǎn)，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[12]；防止蛋白質(zhì)發(fā)生凝固變形，在細(xì)胞蛋白質(zhì)(酶)高級(jí)結(jié)構(gòu)的維持、翻譯后的修飾和輸運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮“小分子伴侶”的生理作用；此外，脯氨酸還直接參與逆境脅迫中O2-、OH-等活性氧清除過(guò)程[13]。因此，可溶性糖、脯氨酸等相溶性溶質(zhì)的含量是植物逆境抗性的重要生理指標(biāo)。

可溶性糖和游離脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果如圖2 所示，低溫脅迫引起了煙草體內(nèi)可溶性糖和脯氨酸的積累。低溫處理第1、3、5、7 d，對(duì)照的可溶性糖含量分別較低溫處理前增加了8.30%、33.60%、83.40%和98.81%，SA、GB、PEG 和5-ALA 處理的可溶性糖含量的增長(zhǎng)均高于對(duì)照，分別為17.98%～33.84%、53.18%～73.56%、96.25%～119.39%、117.98%～134.98%，4種生理活性物質(zhì)的處理效果以5-ALA 略優(yōu)、但差異不顯著（圖2a）。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，脯氨酸含量也表現(xiàn)出了與可溶性糖含量類似的變化，如低溫脅迫第7 天，對(duì)照脯氨酸含量較低溫脅迫前增加了84.51%，4種生理活性物質(zhì)處理的煙苗脯氨酸含量增加幅度為93.90%～115.55%，顯著高于對(duì)照（圖2b）。

綜合來(lái)看，4種生理活性物質(zhì)處理均較對(duì)照進(jìn)一步促進(jìn)了低溫逆境脅迫處理期間可溶性糖和脯氨酸的積累，對(duì)煙苗低溫脅迫的響應(yīng)能力具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)煙草植株的低溫抗性。

2.3 生理活性物質(zhì)處理對(duì)煙草葉片過(guò)氧化氫酶活性和丙二醛含量的影響

植物遭遇逆境脅迫時(shí)，富集的活性氧（ROS）直接氧化損傷細(xì)胞內(nèi)生物大分子，引起一系列生理生化紊亂；同時(shí)，加劇膜脂質(zhì)的氧化程度、破壞生物膜的完整性，增加膜脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的量。另一方面，植物體內(nèi)過(guò)氧化氫酶（CAT）廣泛存在，是植物組織細(xì)胞清除H2O2的主要保護(hù)酶，逆境脅迫下維持有較高的CAT 活性，可減輕活性氧的毒害作用、穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，提高植物的抗逆性[14]。

圖2 生理活性物質(zhì)處理對(duì)煙草可溶性糖(a)、游離脯氨酸(b)含量的影響

從圖3a 可看出，對(duì)照及各處理的煙苗CAT 活性隨低溫脅迫的延長(zhǎng)持續(xù)下降，低溫處理第1、3、5、7 d，對(duì)照較低溫處理前分別降低18.16%、46.78%、70.17%和76.23%，4個(gè)生理活性物質(zhì)處理的降低幅度分別為7.54% ～9.57% 、13.48% ～19.73% 、22.69% ～35.41% 、33.21%～45.61%，均低于對(duì)照組，顯示出4種生理活性物質(zhì)對(duì)CAT 具有較好的保護(hù)作用、CAT 維持有較高的活性。

圖3 生理活性物質(zhì)處理對(duì)煙草過(guò)氧化氫酶活性(a)、丙二醛含量(b)的影響

低溫逆境脅迫可導(dǎo)致煙苗MDA 的產(chǎn)生，并隨低溫脅迫時(shí)間的增加而上升（圖3b），如低溫處理第3 天，對(duì)照較處理前增加了156.8%，而4種生理活性物質(zhì)處理分別增加了62.21%、85.43%、103.42%、65.64%，明顯低于對(duì)照，4種生理活性物質(zhì)處理可減輕低溫逆境脅迫下煙苗MDA 的增加，其中SA、GB 和5-ALA 的處理效果優(yōu)于PEG 處理。

從CAT 活性和MDA 含量變化的結(jié)果來(lái)看，生理活性物質(zhì)處理可減輕低溫脅迫下煙草CAT 活性的下降，減緩生物膜脂質(zhì)氧化損害、對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)具有良好的保護(hù)作用；另外，SA、GB 和5-ALA 這3種生理活性物質(zhì)對(duì)煙苗低溫耐性指標(biāo)改善的生理效果比PEG 處理更為明顯。

2.4 生理活性物質(zhì)處理對(duì)煙草葉片葉綠素含量的影響

低溫逆境脅迫將導(dǎo)致植物光合系統(tǒng)的“低溫光抑制”，葉綠體色素被氧化“漂白”分解是光合系統(tǒng)的低溫傷害之一[15]。此外，煙草生產(chǎn)中“倒春寒”發(fā)生時(shí)期的光照較弱，而在弱光照下植物的光合速率與葉綠素含量存在良好的線性關(guān)系，葉綠素含量直接影響著植物光合作用的水平[16]。

表1 所示結(jié)果表明，低溫脅迫使煙草葉片葉綠素含量逐漸減少。低溫處理第1、3、5、7 d，對(duì)照葉綠素含量分別較低溫處理前減少了11.02%、22.83%、33.86%和39.37%，4種生理活性物質(zhì)處理的減少幅度分別為3.97% ～6.35% 、8.73% ～13.60% 、16.67% ～23.26% 、21.43%～28.00%，均顯著低于對(duì)照，表明這4種生理活性物質(zhì)處理減緩了低溫脅迫所導(dǎo)致的葉綠素分解速度，對(duì)葉綠素有一定的保護(hù)作用。低溫脅迫下煙草的葉綠素保有量較高，可促進(jìn)煙苗光合能力的維持，為保持煙苗的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)吸收、增強(qiáng)煙苗的抗逆性提供基本保障。

表1 低溫脅迫下生理活性物質(zhì)處理煙草葉片葉綠素含量的變化

3 小結(jié)與討論

本研究表明，噴施適宜濃度的水楊酸（SA）、甜菜堿（GB）、聚乙二醇（PEG）和5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），能促進(jìn)低溫脅迫下煙草可溶性糖和游離脯氨酸的積累、減輕過(guò)氧化氫酶活性和葉綠素含量的下降、降低煙草葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量，從而提高了煙草植株的抗寒能力。另外，綜合比較這4種生理活性物質(zhì)的處理效果，初步確定SA、5-ALA 和GB 優(yōu)于PEG，為煙草苗期低溫耐性調(diào)節(jié)劑有效組分篩選提供了參考。

為了確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，后續(xù)研究中：①本實(shí)驗(yàn)使用的生理活性物質(zhì)對(duì)植物抗寒性的其他機(jī)制如煙苗的根系活力、光合活性、水勢(shì)、抗氧化系統(tǒng)等因素的影響有待進(jìn)一步驗(yàn)證；②植物激素或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育、煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)等方面有較大的影響，本研究使用的生理活性物質(zhì)在此方面、尤其是對(duì)煙草品質(zhì)方面的影響如何有待檢測(cè)分析。

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