?？颂婺釋?duì)ACC-M細(xì)胞凋亡的影響

楊彩玲，張景航，任銘新，張應(yīng)花，崔衛(wèi)剛#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔外科 衛(wèi)輝 453100 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理科 新鄉(xiāng) 453003 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453003

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是涎腺最常見的惡性腫瘤之一，具有浸潤性強(qiáng)、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，預(yù)后較差。?？颂婺崾侵袊灾餮邪l(fā)的一種靶向表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，EGFR 和活性氧(reactive oxygen species，ROS)參與了小細(xì)胞肺癌等疾病的發(fā)生。ROS產(chǎn)生與清除間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞的生存與凋亡非常重要?？寡趸甘乔宄齊OS引起的氧化損傷的主要成員;MnSOD能歧化超氧陰離子形成過氧化氫，清除ROS引起的氧化損傷，是線粒體中重要的抗氧化酶[3-4]。作者觀察了?？颂婺釋?duì)ACC-M細(xì)胞凋亡以及MnSOD在線粒體的表達(dá)和對(duì)ROS生成的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ACC-M細(xì)胞株由上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。ACC-M細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的培養(yǎng)液中，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。埃克替尼由浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)，用DMSO溶解，分裝后－20℃保存。DCFH-DA試劑(Molecular Probes公司)，Caspase-3活力檢測試劑盒(Sigma公司)，MnTMPyP(Calbiochem Merk公司)，兔抗MnSOD一抗(Santa Cruz公司)，抗兔二抗(KPL公司)。

1.2 細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為6組:對(duì)照組，低、中、高劑量?？颂婺峤M(10、20、40 μmol/L ?？颂婺崽幚?24 h)，MnTMPyP 組(10 μmol/L MnTMPyP 處理 24 h)，MnTMPyP+?？颂婺峤M(10 μmol/L的MnTMPyP預(yù)孵育1 h，再加入40 μmol/L?？颂婺崽幚?4 h)。

1.3 ACC-M細(xì)胞Caspase-3蛋白活力的檢測 根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行。收集處理后的各組細(xì)胞，在冰上用裂解液孵育30 min，16000 r/min 4℃離心10 min，收集上清液，用底物37℃孵育90 min，Caspase-3活力用分光光度計(jì)在405 nm進(jìn)行測量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:試劑盒提供的4-硝基苯胺用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為 0、10、20、50、100 和 200 μmol/L，作為標(biāo)準(zhǔn)品并繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算樣品中Caspase-3蛋白的活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 ACC-M細(xì)胞活性的檢測 向各孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，37℃孵育4 h，1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，加入相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，振蕩10 min，測定490 nm波長處的吸光度。細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ACC-M細(xì)胞ROS水平的檢測 ROS含量用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行檢測。細(xì)胞在含10 mmol/L DCFH-DA的培養(yǎng)基中孵育30 min，經(jīng)埃克替尼和(或)MnTMPyP處理細(xì)胞后，熒光分光光度計(jì)測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平值(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。ROS水平=實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 ACC-M細(xì)胞總蛋白、線粒體及胞質(zhì)中Mn-SOD蛋白表達(dá)水平的檢測 細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)蛋白提取參照線粒體提取試劑盒說明書進(jìn)行。收集各組處理后的細(xì)胞，加入預(yù)冷的Mito-cytoBuffer重懸細(xì)胞，1000 r/min離心5 min。取上清，4℃、1000 r/min離心5 min。再取上清，4℃、12000 r/min離心10 min。取上清即為胞質(zhì)，提取胞質(zhì)蛋白，用于胞質(zhì)蛋白成分的檢測。線粒體沉淀位于管底，加入0.2 mL Mito-CytoBuffer重懸，12000 r/min離心10 min，棄上清;全細(xì)胞蛋白裂解緩沖液重懸沉淀，測蛋白濃度，保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法測定提取蛋白濃度，配置體積分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行蛋白電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，加入兔抗MnSOD一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗 10 min×3次，加入抗兔二抗，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光、顯影和定影。β-actin為內(nèi)參。成像分析儀掃描并保存，目的蛋白的表達(dá)水平用目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS的水平及MnSOD蛋白表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS水平的比較 見表1。由表1可見，不同濃度的埃克替尼可以抑制ACC-M細(xì)胞活性，誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞Caspase-3的活力增加，促進(jìn)ACC-M細(xì)胞ROS的生成，而MnTMPyP可拮抗上述變化。

表1 各組細(xì)胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS水平的比較(n=3) %

2.2 各組細(xì)胞總蛋白、線粒體及胞質(zhì)中MnSOD蛋白的表達(dá)水平 見圖1，表2。?？颂婺崽幚硪鹆薓nSOD由線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放。MnTMPyP預(yù)處理ACC-M細(xì)胞1 h能逆轉(zhuǎn)?？颂婺嵋鹁€粒體Mn-SOD向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。

圖1 各組細(xì)胞MnSOD蛋白的表達(dá)

表2 各組細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)MnSOD蛋白的表達(dá)比較(n=3) %

3 討論

細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Caspase-3通過抑制DNA修復(fù)，啟動(dòng)DNA的降解，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。?？颂婺崾且环NEGFR-TKI，可抑制人鱗狀上皮細(xì)胞癌A431細(xì)胞系等腫瘤細(xì)胞的生長和增殖[5-6]。該研究結(jié)果顯示:?？颂婺嵩谳^低濃度時(shí)即可抑制ACC-M細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞中Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白的活力增加，說明?？颂婺崮苷T導(dǎo)ACC-M細(xì)胞發(fā)生凋亡。

ROS與腫瘤形成密切相關(guān)，是多種藥物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)重要信號(hào)分子。研究[7-8]顯示ROS與EGFR-TKI促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)，埃克替尼可促進(jìn)ACC-M細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，與上述研究相符。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)利用MnTMPyP預(yù)處理ACC-M細(xì)胞1 h能阻斷?？颂婺嵴T導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活力的增加，表明ROS在埃克替尼誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。

MnSOD是線粒體中非常重要的抗氧化因子。MnSOD歧化超氧陰離子形成過氧化氫，使超氧陰離子失去氧化能力。MnSOD蛋白先在胞質(zhì)中翻譯形成然后轉(zhuǎn)位到線粒體;MnSOD蛋白的正確定位對(duì)其發(fā)揮功能非常重要[9]。該研究顯示，MnSOD模擬物MnTMPyP能夠阻斷?？颂婺嵴T導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活力的增加，據(jù)此推測，MnSOD可能在?？颂婺嵴T導(dǎo)ROS生成過程中發(fā)揮著重要作用。此外，該研究還顯示?？颂婺崽幚砗?，MnSOD蛋白在ACC-M細(xì)胞線粒體的表達(dá)減少，在胞質(zhì)中的表達(dá)增加。推測MnSOD從線粒體向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位可能參與了?？颂婺嵴T導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;MnSOD不能及時(shí)清除線粒體呼吸鏈上產(chǎn)生的氧離子，從而引起細(xì)胞ROS的積累。

綜上所述，?？颂婺嵴T導(dǎo)了Caspase-3蛋白活力增強(qiáng)和ROS的生成，ROS在?？颂婺嵴T導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，該作用可能與MnSOD從線粒體向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位有關(guān)。

[1]Yamaguchi H，Hsu JL，Chen CT，et al.Caspase-independent cell death is involved in the negative effect of EGF receptor inhibitors on cisplatin in non-small cell lung cancer cells[J].Clin Cancer Res，2013，19(4):845

[2]穆曉東，張曄，曲秀娟，等.鹽酸?？颂婺釋?duì)人肺癌HCC827細(xì)胞Akt通路活化和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21(4):686

[3]Kroller-Schon S，Steven S，Kossmann S，et al.Molecular mechanisms of the crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase through reactive oxygen species-studies in white blood cells and in animal models[J].Antioxid Redox Signal，2014，20(2):247

[4]陳堅(jiān)，林庚金，劉珊林.活性氧、錳型超氧化物歧化酶對(duì)胃腸道腫瘤凋亡的影響[J].國際消化病雜志，2006，26(3):186

[5]Gao Z，Chen W，Zhang X，et al.Icotinib，a potent and specific EGFR tyrosine kinase inhibitor，inhibits growth of squamous cell carcinoma cell line A431 through negatively regulating AKT signaling[J].Biomed Pharmacother，2013，67(5):351

[6]Camidge DR.Icotinib:kick-starting the Chinese anticancer drug industry[J].Lancet Oncol，2013，14(10):913

[7]Shankaran H，Chrisler WB，Sontag RL，et al.Inhibition of ERK oscillations by ionizing radiation and reactive oxygen species[J].Mol Carcinog，2011，50(6):424

[8]Yang J，Li Q，Zhou XD，et al.Naringenin attenuates mucous hypersecretion by modulating reactive oxygen species production and inhibiting NF-kappaB activity via EGFR-PI3KAkt/ERK MAPKinase signaling in human airway epithelial cells[J].Mol Cell Biochem，2011，351(1/2):29

[9]Razandi M，Pedram A，Jordan VC，et al.Tamoxifen regulates cell fate through mitochondrial estrogen receptor beta in breast cancer[J].Oncogene，2013，32(27):3274