陳力玉　張淑卿　李劍峰　等

摘要：將含有cfp（cyan fluorescent protein）基因質粒的熒光標記根瘤菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26、S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接種于甘農5號紫花苜蓿，測定苜蓿幼苗生物量、單株結瘤數(shù)、固氮酶活性等，結果表明：熒光標記根瘤菌可有效促進植株生長和生物量的積累，有明顯促生效果；與出發(fā)菌相比，熒光標記根瘤菌未對苜蓿幼苗產生顯著的不良影響，能在植物體內穩(wěn)定表達，具有與出發(fā)菌株相近的促生能力。

關鍵詞：根瘤菌；接種；苜蓿幼苗；生物量；固氮酶活性

中圖分類號：S 154.37；S 54文獻標識碼：A文章編號：10095500（2013）06000108

固氮效率由根瘤菌和豆科植物雙方的基因所控制，豆科植物相關基因與根瘤菌相關基因的相容性決定了根瘤菌侵染豆科植物的有效性[1]。接種根瘤菌釋放至田間后，必然要與土著根瘤菌及種子內生根瘤菌[2]在土壤營養(yǎng)、生活空間及宿主植物等方面進行競爭，接種根瘤菌能否正常結瘤直接取決于其競爭力的大小。

目前，對于cfp基因用于苜蓿根瘤菌的研究較少，為檢測cfp基因標記后的根瘤菌能否侵染植物根系并結瘤，將含有cfp基因的質粒的熒光標記根瘤菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26、S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接種于甘農5號紫花苜蓿（Medicago sativa cv.Gannong No.5），以不接種的處理為對照，觀察導入的cfp基因在植物體內能否正常表達，比較出發(fā)菌S.LZgn5、S.12531和S.LH3436及其cfp熒光標記菌對苜蓿幼苗的影響。

1材料和方法

1.1供試種子

甘農5號紫花苜蓿種子，由草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室提供。

試驗培養(yǎng)基為TY培養(yǎng)基[3]，酵母甘露醇液體培養(yǎng)基[4]和Hoagland無氮營養(yǎng)液[5]。

1.2菌株

出發(fā)菌S.LZgn5及其熒光標記菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，出發(fā)菌S.12531及其熒光標記菌S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26。

出發(fā)菌S.LH3436及其熒光標記菌S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6。

1.3試驗方法

1.3.1種子表面滅菌

取適量甘農5號紫花苜蓿種子，置于已滅菌的三角瓶，用無菌水洗滌2次，加入75%的乙醇浸泡3 min，無菌水清洗4次，每次2 min，0.1%的HgCl2浸泡3 min，無菌水清洗4次，每次2 min。將表面滅菌的種子置于YMA培養(yǎng)基，觀察是否有菌長出，檢測表面滅菌是否徹底。

1.3.2苜蓿種子的發(fā)芽處理

將培養(yǎng)皿和濾紙121 ℃滅菌26 min，然后在無菌培養(yǎng)皿中放入雙層無菌濾紙[6]，將表面滅菌的甘農5號紫花苜蓿種子均勻置于

1.3.3制備菌液及接種

將苜蓿根瘤菌及其熒光標記菌，分別轉接到裝有100 mLYMA液體培養(yǎng)基的三角瓶，將三角瓶置于搖床，28 ℃，120 rmin培養(yǎng)至在OD600 nm的吸光度達到0.5～0.8。

1.4測定指標和方法

1.4.1生長指標的測定

在苜蓿苗生長的第46 d，將苜蓿苗和河砂從杯中整體取出，用水沖洗，至苜蓿苗根系完全沖洗干凈，在水中將苜蓿苗根系分開，盡量保持根的完整性，用濾紙吸干植株表面水分。

（1）測量苜蓿苗的株高及根長。

（2）對各處理的葉片數(shù)進行計數(shù)。

（3）選取植株自上而下倒數(shù)第2個分枝中間的葉片，采用描形稱重法[8]測定葉片的葉面積，每處理3次重復。

（4）稱量地上鮮重、根鮮重，每處理3次重復，稱鮮重后置于烘箱中，105 ℃處理20 min，80 ℃連續(xù)烘干12 h后稱其干重。

1.4.2固氮能力測定

（1）單株結瘤數(shù)采用苜蓿苗根瘤計數(shù)。

（2）根瘤等級的劃分[9]采用5分制：1分根瘤為中空無內容物的死亡根瘤；2分根瘤為切面灰白色的無效根瘤；3分根瘤切面略呈粉紅色，但直徑小于<0.5 mm；4分根瘤切面呈粉紅色，1 mm>直徑≥0.5 mm；5分根瘤切面呈粉紅色，直徑≥1 mm。

（3）根瘤固氮酶活性的測定：各回接植株根瘤的固氮酶活性采用乙炔還原法[10]。在根瘤兩端根系0.5 cm處，將根瘤切下，稱其鮮重0.1 g，置于盛有濕潤濾紙片的17 mL西林瓶中，蓋緊瓶塞，并以保鮮膜密封，每處理3次重復，以2 mL的無菌注射器抽出1.7 mL的瓶內空氣，再注入1.7 mL乙炔氣體，其終濃度為10%。室溫下反應1 h后，以100 μL進樣器抽取西林瓶內氣體50 μL，用GC7890F氣相色譜儀測定各處理在1 h內生成的乙烯氣體含量（μmol），計算植株根瘤的固氮酶活性，（μmolh·g）[11]。

（4）熒光標記菌占瘤率的檢測選取各處理植株生長良好的根瘤，從根瘤兩端根系0.5 cm處將根瘤切下[12]，各稱取0.01 g，用無菌水沖洗2次，再以75%的乙醇處理5～10 s，破除表面張力，去除組織上的氣泡，無菌水沖洗4次；以碘伏浸泡2 min，用無菌水沖洗干凈；將根瘤轉移至無菌研缽中，加入4 mL無菌水研磨充分后轉移至5 mL無菌離心管中，5 000 rmin離心5 min；再吸取0.2 mL上清液涂抹于TY平板，每處理3次重復，待菌落長出后，以手提式紫外燈（OD336 nm）照射，計數(shù)并拍照。

1.4.3葉綠素含量測定[13]

取各處理長勢相似植株至上而下第二個分枝的苜蓿葉片，各稱取0.1 g剪碎，測定葉綠素含量。

以Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)整理，用IBM16.0 SPSS分析軟件以Duncan法進行數(shù)據(jù)分析。

2結果與分析

2.1熒光標記菌及其出發(fā)菌株對苜蓿幼苗生物量的影響

生物量的大小反映了植株積累物質能力的強弱，接種的苜蓿幼苗的根鮮重和干重、地上部分鮮重和干重均高于未接種的處理。其中，進行S.LZgn5，S.LZgn5cfp6，S.LZgn5cfp16和S.LZgn5cfp28接種的苜蓿幼苗的根鮮重高出對照163.8%～208.4%，根干重高出對照167.9%～225.9%，地上鮮重高出對照76.4%～107.2%，地上干重高出對照88.9%～99.7%，均與對照差異顯著（P<0.05），表明S.LZgn5及其熒光標記菌具有一定的促生作用。

S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接種后苜蓿幼苗的根鮮重、根干重、地上鮮重和干重分別比出發(fā)菌S.LZgn5高出3.2%～16.9%、4.6%～21.6%、3.2%～17.5%和2.4%～5.7%，但差異均不顯著（P<0.05），說明S.LZgn5的熒光標記菌的接種并沒有影響苜蓿幼苗生物量的積累，而是促進了生物量的增加，以S.LZgn5cfp6表現(xiàn)較好。

S.12531及其熒光標記菌的接種提高了苜蓿幼苗生物量；其中，根鮮重、根干重、地上鮮重和干重

2.2熒光標記菌及其出發(fā)菌株對苜蓿幼苗根長、株高等的影響

2.3熒光標記菌及其出發(fā)菌株對苜蓿幼苗固氮能力的影響

苜蓿根瘤的固氮酶活性大小反映了根瘤中根瘤菌固定氮素能力的強弱，能否在原寄主上形成有效根瘤是確認根瘤菌是否有效的基本方法。S.LZgn5及其熒光標記菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接種的苜蓿幼苗的單株結瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性和根瘤等級均與對照存在顯著差異（P<0.05），其中，固氮酶活性是對照的12.4～14.4倍，可見，根瘤菌S.LZgn5及其熒光標記菌的接種提高了根瘤的固氮酶活性，S.LZgn5cfp6較好。

S.LZgn5cfp6，S.LZgn5cfp16和S.LZgn5cfp28接種的苜蓿幼苗的單株結瘤數(shù)、固氮酶活性及根瘤等級比出發(fā)菌S.LZgn5高出15.7%，5.1%和6.2%，無顯著差異（P>0.05）；熒光標記菌的占瘤率與50%相比，無顯著差異，說明熒光標記菌具有一定的與種子內生根瘤菌競爭的能力。

2.4熒光標記菌及其出發(fā)菌株對苜蓿幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素含量的高低反應了植物光合作用的強弱，也間接體現(xiàn)了植株利用氮素能力的強弱。S.LZgn5及其熒光標記菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接種的苜蓿幼苗的葉片葉綠素含量比對照高出52.3%～67.1%（圖1），差異顯著（P<0.05），各熒光標記根瘤菌與出發(fā)菌相比，無顯著差異。

S.12531及其熒光標記菌S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26接種的苜蓿幼苗的葉片葉綠素含量比對照高出57.7%～63.7%（圖2），差異顯著（P<0.05），而各熒光標記根瘤菌與出發(fā)菌相比，無顯著差異。

3討論

根瘤菌為微好氧[15]的革蘭氏陰性桿狀細菌，能與植物共生，固定氮素供給宿主營養(yǎng)。有研究表明，根瘤菌的接種可顯著提高植物產量。目前，美國有80%的苜蓿在播種之前進行根瘤菌接種，加拿大和澳大利亞幾乎所有苜蓿在播種之前都要進行根瘤菌接種，我國從1981年開始進行苜蓿根瘤菌優(yōu)良菌株的篩選。研究中，各出發(fā)菌與其熒光標記菌接種苜蓿幼苗的地上鮮重和干重、根鮮重和干重、根長、株高和固氮酶活性等均顯著（P<0.05）高于未接種的處理，說明出發(fā)菌與其熒光標記菌均具有明顯的促生作用，且熒光標記根瘤菌不會對苜蓿幼苗的根系產生影響。

試驗中，無菌環(huán)境下表面消毒的苜蓿種子仍可結瘤，且各熒光標記菌接種于苜蓿幼苗后，占瘤率并未達到100%，說明在熒光標記菌接種的苜蓿幼苗根瘤中有其他根瘤菌的存在，這也印證了張淑卿的推論[2]，即苜蓿種子內部攜帶有根瘤菌，同時在苜蓿種子發(fā)芽過程中，種皮吸水膨脹，其攜帶的根瘤菌隨種皮浸出液分布于胚根根際的土壤，完成種子內生根瘤菌的接種；熒光質粒的復制需借助于根瘤菌細胞產生的能量，而根瘤菌侵染植株根系和結瘤固氮又是高耗能的生理過程，因此，根瘤菌細胞和其熒光質粒間正常和諧的運作是熒光標記根瘤菌能否成功侵染根系的重要方面，在進入植株根系后，熒光標記根瘤菌必然要與種帶根瘤菌競爭生存空間和養(yǎng)分供給，能否在植株根系形成有效根瘤決定于競爭結瘤能力的大小[16，17]。

試驗研究中，在各熒光標記根瘤菌回接的苜蓿幼苗的根瘤中，均檢測出熒光標記根瘤菌，S.LZgn5和S.LH3436的熒光標記根瘤菌的占瘤率與50%相比無顯著差異，說明熒光標記根瘤菌的競爭結瘤能力與種子內生根瘤菌相當，熒光質粒的導入沒有顯著影響根瘤菌的競爭結瘤能力；S.12531的熒光標記根瘤菌的占瘤率均高于50%，與50%相比[14]差異顯著（P<0.05），說明各熒光標記根瘤菌均能成功侵染和結瘤，表明熒光質粒的導入并未對菌株的侵染和結瘤能力有顯著的負面影響。

導入外源質粒的標記菌對宿主的侵染結瘤及促生能力與菌種自身的性質、宿主植物的種類與質粒類型相關[19，20]。李杰[18]等運用三親本雜交法將帶有l(wèi)uxAB和parCBA基因的重組質粒pHN208導入到6株大豆根瘤菌中，通過接種試驗證明PHN208的導入并不影響根瘤菌的競爭結瘤能力。本研究通過S.LZgn5、S.LH3436和S.12531的熒光標記根瘤菌的接種試驗，測定接種苜蓿幼苗的生物量、固氮能力指標和葉片葉綠素含量等指標，結果顯示外源質粒的導入未影響標記菌的競爭結瘤能力。

4結論

4.1熒光標記菌根瘤菌的促生作用

S.LZgn5，S.12531和S.LH3436及其熒光標記菌根瘤菌接種苜蓿幼苗的根鮮重和干重、地上部分鮮重和干重、根瘤固氮酶活性、根長、株高和葉綠素含量等均顯著（P<0.05）高于未接種的處理。這說明接種本研究涉及的含熒光質粒的根瘤菌可有效促進植株的生長和生物量的積累，具有明顯的促生效果。

4.2熒光標記根瘤菌與出發(fā)菌接種效果的比較

（1）各熒光標記根瘤菌接種苜蓿幼苗的根鮮重和干重、地上部分鮮重和干重、株高和根長等與對應的出發(fā)菌相比，無顯著差異。表明熒光質粒的導入沒有影響菌株對苜蓿幼苗生物量積累的促進效果。

（2）在固氮能力指標中，各熒光標記根瘤菌與其對應的出發(fā)菌在接種的苜蓿幼苗的單株結瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性、根瘤等級評分和占瘤率方面的表現(xiàn)有差異。

S.12531cfp13接種苜蓿幼苗的根瘤固氮酶活性比S.12531高出42.9%，差異顯著（P<0.05）；且各熒光標記根瘤菌的占瘤率均高于50%，差異顯著（P<0.05）。

S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接種的苜蓿幼苗的根瘤數(shù)均低于出發(fā)菌株S.LH3436，差異顯著（P<0.05），S.LH3436cfp6接種的苜蓿幼苗的根瘤固氮酶活性和根瘤等級評分要高于出發(fā)菌S.LH3436，差異顯著（P<0.05）。

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