吳露露，劉 洋，劉 琦，汪岱迪，宗衛(wèi)峰

(江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇南京210008)

硼替佐米是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的蛋白酶體抑制劑，于2003年5月以商品名萬珂(Velcade)被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)最先批準(zhǔn)用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤，在2008年6月被批準(zhǔn)為一線治療藥物，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)顯示其對(duì)多發(fā)性骨髓瘤具有良好的療效［1］，同時(shí)可克服化療耐藥性［2］。作為新一代有效治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物，它通過全新的機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用，在惡性疾病的治療中顯示出廣泛的應(yīng)用前景。

硼替佐米不溶于水，且高濃度的硼替佐米溶液對(duì)鱟試劑(TAL)與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)有干擾作用，而注射級(jí)的硼替佐米需要進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原等安全性項(xiàng)目的控制，有關(guān)硼替佐米的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法學(xué)一直未見有文獻(xiàn)報(bào)道。由于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)一般都要在水溶液中進(jìn)行，只有樣品完全溶解才能確保內(nèi)毒素不被樣品包裹而釋放，為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確及操作簡(jiǎn)便可行，本文探索一種新的思路即將不溶于水的藥物硼替佐米按制劑工藝的比例加入一定濃度的助溶劑(甘露醇)溶液使藥物溶解，再用BET水稀釋建立了凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查并經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，以完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該產(chǎn)品采用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查提供科學(xué)依據(jù)，并為水不溶性藥物建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)材料

硼替佐米(某企業(yè)提供，規(guī)格:原料，批號(hào):2618－15－25、2618－24－25、2618－33－25);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格:0.1 mL，批號(hào):1209052，靈敏度:0.125 EU·mL－1;規(guī)格:0.1 mL，批號(hào):1211081，靈敏度:0.06 EU·mL－1。湛江博康海洋生物有限公司，規(guī)格:0.1 mL，批號(hào):1209140，靈敏度:0.125 EU·mL－1;規(guī)格:0.1 mL，批號(hào):1207131，靈敏度:0.06 EU·mL－1);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，規(guī)格:1 mL，批號(hào):150601－201174，效價(jià):160 EU/支);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，中國(guó)藥品生物制品檢定所，規(guī)格:5 mL，批號(hào):201208);10%的甘露醇溶液(某企業(yè)提供，規(guī)格:250 mL:50 g，批號(hào):130107120，BET 水無菌配制)。

2 方法與結(jié)果［3，4］

2.1 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定 硼替佐米臨床用量為1.3 mg·m－2，按公式:L=K/M 計(jì)算［M為1.3 mg·m－2×1.62 m2·(60 kg·h)－1，K 為 5 EU·(kg·h)－1］本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=K/M=［5 EU·(kg·h)－1］/［1.3 mg·m－2×1.62 m2·(60 kg·h)－1］=142 EU·mg－1。由于注射用硼替佐米(制劑)推薦的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為應(yīng)小于25 EU·mg－1?？紤]到臨床用藥的安全因素以及與本品制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素限值保持一致，所以也將硼替佐米(原料)的細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為應(yīng)小于25 EU·mg－1。

2.2 鱟試劑靈敏度的復(fù)核 按照《中國(guó)藥典》2010年版(二部)附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求復(fù)核所用鱟試劑，結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3 干擾預(yù)試驗(yàn) 目前市售鱟試劑λ一般為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL－1，將硼替佐米分別用10%的甘露醇溶液溶解并用BET水稀釋成0.02、0.01、0.005、0.002 5 和 0.001 25 mg·mL－1，將此系列溶液記為NPC。同時(shí)在上述試驗(yàn)液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每一濃度的試驗(yàn)液中均含有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記此系列溶液為PPC。取靈敏度為0.125 EU·mL－1的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC和PPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)兩管，并設(shè)陰性對(duì)照(NC)和陽(yáng)性對(duì)照(PC)，結(jié)果見表1。

預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示:硼替佐米在濃度為0.02及0.01 mg·mL－1時(shí)對(duì)湛江安度斯生物有限公司鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)有明顯干擾抑制作用，在濃度為0.02、0.01 和0.005 mg·mL－1濃度時(shí)，對(duì)湛江博康海洋生物有限公司鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)有明顯干擾抑制作用。對(duì)兩個(gè)廠家鱟試劑均無干擾的濃度為 0.002 5 mg·mL－1、0.001 25 mg·mL－1，因此，正式干擾試驗(yàn)的濃度選擇為0.002 5 mg·mL－1。

2.4 正式干擾試驗(yàn) 為了最終確認(rèn)是否存在抑制因素的影響，取硼替佐米分別用10%的甘露醇溶液溶解并用BET水稀釋，使其最終干擾試驗(yàn)濃度為0.002 5 mg·mL－1，進(jìn)行以下正式干擾試驗(yàn)。

取靈敏度為0.06 EU·mL－1的兩個(gè)廠家鱟試劑，按《中國(guó)藥典》2010年版(二部)附錄中的供試品干擾試驗(yàn)項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 硼替佐米的正式干擾試驗(yàn)

表2結(jié)果表明:Es在0.5～2.0 λ(包括0.5 λ 和2.0 λ)范圍之內(nèi)，Et則在0.5 ～2.0 Es(包括0.5 Es和2.0 Es)范圍之內(nèi)。供試品在0.002 5 mg·mL－1濃度下，對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)均無明顯干擾抑制作用。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)的制定及供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 根據(jù)上述干擾試驗(yàn)的結(jié)果，制定的硼替佐米的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)為:取本品細(xì)粉適量，加10%的甘露醇溶液溶解并稀釋制成含硼替佐米為 5 mg·mL－1溶液后，依法檢查［《中國(guó)藥典》2010年版(二部)附錄ⅪE)，每1 mg硼替佐米中內(nèi)毒素含量應(yīng)小于25 EU。

根據(jù)上述檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，按《中國(guó)藥典》2010年版(二部)附錄Ⅺ E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，取靈敏度為0.06 EU·mL－1的的兩個(gè)廠家鱟試劑，分別對(duì)3批供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。并同時(shí)設(shè)立供試品陽(yáng)性對(duì)照管(PPC)、NC管和PC管。

試驗(yàn)時(shí)，每批供試品取鱟試劑8支，分別用0.1 mL BET水溶解，其中2支加入供試品溶液(NPC)，2支加入供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液(PPC)，2支加入陰性對(duì)照溶液(NC)，2支加入陽(yáng)性對(duì)照溶液(PC)，各種藥液的加樣量均為0.1 mL，37℃孵育60 min后觀察結(jié)果，結(jié)果見表3。

表3 硼替佐米的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3批硼替佐米的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查表明，供試品經(jīng)兩個(gè)廠家的鱟試劑檢驗(yàn)，結(jié)果均為符合規(guī)定。

3 討論

因鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)需在水溶液體系中進(jìn)行，因此凝結(jié)法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查會(huì)不同程度受到水不溶性藥物或物質(zhì)本身或提取方法及提取溶劑等因素的影響，從而干擾測(cè)定結(jié)果，國(guó)外除了采用標(biāo)準(zhǔn)化的方法，還研究了一些替代方法以確保結(jié)果的可靠準(zhǔn)確［5，6］。國(guó)內(nèi)對(duì)不溶于水的藥物或制劑常采用加水振蕩萃?。?］或加入有機(jī)溶劑溶解，但前者并未提供回收率的數(shù)據(jù)，后者常出現(xiàn)加有機(jī)溶劑溶解后再加水稀釋時(shí)樣品重新析出或有機(jī)溶劑破壞內(nèi)毒素的現(xiàn)象。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確及操作簡(jiǎn)便可行，本文探索一種新的思路即將不溶于水藥物硼替佐米按制劑工藝加入一定濃度的助溶劑(甘露醇)溶液(硼替佐米－甘露醇之比為1∶10)使藥物溶解，再用BET水稀釋，制成均一的溶液進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)和干擾確證試驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定。試驗(yàn)使用兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，對(duì)3批樣品分別進(jìn)行了干擾試驗(yàn)，結(jié)果表明，高濃度硼替佐米對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)有干擾作用，在濃度稀釋至0.002 5 mg·mL－1時(shí)即可排除干擾作用。綜上所述，筆者認(rèn)為硼替佐米原料經(jīng)甘露醇溶液助溶后，可以采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行質(zhì)量控制。

［1］王凡，趙春亭.硼替佐米致周圍神經(jīng)病變機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013，7(6):2641－2643.

［2］王立琳，肖若芝.蛋白酶體抑制劑—硼替佐米的臨床治療研究進(jìn)展［J］.國(guó)際內(nèi)科學(xué)雜志，2008，35(11):657－661.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄99－102，附錄212－215.

［4］中國(guó)藥品生物制品檢定所，中國(guó)藥品檢驗(yàn)總所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范(2010版)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:287.

［5］Smulders S，Kaiser JP，Zuin S，et al.Contamination of nanoparticles by endotoxin:evaluation of different test methods［J］.Part Fibre Toxicol，2012，9:41

［6］Spaan S，Heederik DJ，Thorne PS，et al.Optimization of airborne endotoxin exposure assessment:effects of filter type，transport conditions，extraction solutions，and storage of samples and extracts［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73(19):6134－6143.

［7］胡容融.注射用油細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，18(2):99 －101.