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      親子鑒定中四配子異源嵌合體報道1例

      2014-10-26 05:51:48芳,陳儉,付穎,黃
      中國司法鑒定 2014年4期
      關(guān)鍵詞:峰高嵌合體異源

      陳 芳,陳 儉,付 穎,黃 瓊

      (浙江大學(xué),浙江 杭州 310000;浙江大學(xué)司法鑒定中心,浙江 杭州 310000)

      1 簡要案情

      2013年6月,當(dāng)事人李某帶著女兒來鑒定中心,要求鑒定是否存在親生血緣關(guān)系,在案件受理過程中,當(dāng)事人提出曾經(jīng)去兩家鑒定機構(gòu)做過親子鑒定,且兩家鑒定機構(gòu)鑒定結(jié)論不一致,要求重新鑒定。按照知情同意原則,采集了被鑒定人三份不同的檢材,分別是血樣,口腔拭子及帶毛囊毛發(fā),并要求當(dāng)事人提供孩子生母血樣。當(dāng)事人李某(以下稱父親)、孩子生母(以下稱母親)及女兒無輸血史,無骨髓移植及放療化療史等,李某女兒外觀正常,女性特征明顯。

      2 檢驗方法

      2.1 染色體核型檢測

      外周血淋巴細胞培養(yǎng)[1],常規(guī)制備染色體,G顯帶,鏡下計數(shù)及分析核型。

      2.2 DNA提取

      采用常規(guī)Chelex-100法[2]分別提取父親、母親及女兒血樣、口腔拭子、帶毛囊毛發(fā)檢材DNA,分別采用GoldeneyeTM20A試劑盒(北京基點認知),Identifiler試劑盒(美國AB公司),AGCU21+1試劑盒(無錫中德美聯(lián))進行39個常染色體STR基因座的分型,采用GoldeneyeTM20Y試劑盒(北京基點認知)進行20個Y-STR基因座的分型,采用Investigator Argus X-12試劑盒(德國QIAGEN)進行12個X-STR基因座的分型,擴增體系和擴增程序按相關(guān)操作手冊進行。

      2.3 DNA分型

      采用9700型PCR儀(美國AB公司)進行PCR擴增,使用3130型遺傳分析儀(美國AB公司)進行電泳分離,使用 GeneMapper ID v3.2.1 軟件(美國 AB 公司)處理電泳數(shù)據(jù),實驗過程參照操作手冊和相關(guān)文獻。

      3 檢驗結(jié)果

      3.1 染色體核型分析

      外周血淋巴細胞:核型為46,XX/46,XY兩個細胞系(見圖 1),其中 46,XX(54%),46,XY(46%)。

      圖1 李某女兒核型分型圖,顯示有兩個細胞系,分別為46,XX/46,XY

      3.2 STR基因分型

      在 39個常染色體 STR檢測中(見表 1~2),父親及母親常染色體STR均正常。女兒血樣、口腔拭子、毛發(fā)檢材基因分型一致,在D19S433、D21S11、D18S51、CSF1PO、D8S1179、D2S1338、D22S1045 等 7個基因座出現(xiàn)三等位基因,且在D5S818、D3S1358、D2S441、D1S1677等4個基因座出現(xiàn)等位基因峰高不均衡現(xiàn)象,并且Amelogenin基因座均擴增出等位基因Y,且等位基因X和Y峰高不均衡(見圖2)。

      圖2 依次為父親、母親、女兒血樣、口腔拭子、毛發(fā)常染色體STR分型圖

      D19S433基因座,有3個等位基因12.2/13/14,峰高不均衡,父親的兩個等位基因12.2/14全部遺傳給子代,等位基因13來源于母親;D21S11基因座,有3個等位基因31/32.2/33.2,峰高不均衡,父親的2個等位基因31/33.2全部遺傳給子代,等位基因32.2來源于母親;D18S51基因座,有3個等位基因16/19/21,峰高不均衡,父親的2個等位基因16/19全部遺傳給子代,等位基因21來源于母親;CSF1PO基因座,有3個等位基因10/11/12,峰高不均衡,父親的2個等位基因10/11全部遺傳給子代,等位基因12來源于母親,D8S1179基因座,有3個等位基因10/12/15,峰高不均衡,父親的2個等位基因10/15全部遺傳給子代,等位基因12來源于母親;D2S1338基因座,有3個等位基因17/19/23,峰高不均衡,父親的2個等位基因17/19全部遺傳給子代,等位基因23來源于母親;D22S1045有3個等位基因11/15/16,峰高不均衡,父親的2個等位基因11/16全部遺傳給子代,等位基因15 來源于 母 親 ;D5S818、D3S1358、D2S441、D1S1677等基因座,存在等位基因不均衡的現(xiàn)象,因父親與母親有一個相同的等位基因,父親的等位基因全部遺傳給子代,母親遺傳給子代的等位基因與父親相同,故峰高比接近3∶1。以上11個基因提示女兒在血樣、口腔拭子及毛發(fā)中存在著明顯的嵌合現(xiàn)象,存在著兩個不同的細胞系(46,XX/46,XY),且兩個細胞系所占有的比例不一致。

      表1 父親、母親、女兒血樣、口腔拭子、毛發(fā)常染色體近著絲粒端STR分型結(jié)果

      表2 父親、母親、女兒血樣、口腔拭子、毛發(fā)常染色體末梢STR分型結(jié)果

      續(xù)表2

      分別對血痕,口腔拭子和毛發(fā)檢材采用GoldeneyeTM20Y試劑盒進行19個Y-STR基因座擴增,女兒血樣、口腔拭子及毛發(fā)檢材均擴增出等位基因,且基因座分型與父親基因座分型一致。

      分別對血痕,口腔拭子和毛發(fā)檢材采用Investigator Argus X一12試劑盒進行12個X-STR基因座擴增,女兒血樣、口腔拭子及毛發(fā)X-STR分型結(jié)果除Amelogenin基因座外,其它基因座分型結(jié)果一致,女兒血樣、口腔拭子的Amelogenin基因座等位基因為X/Y.峰高不均衡,而毛發(fā)Amelogenin基因座未見Y等位基因,除DXS10146基因座外,女兒血樣,口腔拭子及毛發(fā)檢材等位基因均能從父親及母親中找到來源,DXS10146基因座女兒等位基因為29/30,父親等位基因為30,母親等位基因為30/32,不符合孟德爾遺傳定律,等位基因29找不到來源,推斷女兒在DXS10146基因座發(fā)生基因突變。

      12個X-STR基因座檢測中,女兒血樣Amelogenin基因座檢測出Y等位基因,說明有兩個細胞系存在,而其它基因座峰高比基本均衡,女兒口腔拭子Amelogenin基因座也檢測出Y等位基因,說明有兩個細胞系存在,其他基因座等位基因峰高不均衡,來自父親的等位基因峰高明顯比來自母親的等位基因峰低,口腔拭子中46,XY細胞系所占的比例比血樣中46,XY細胞系所占比例高。女兒毛發(fā)檢材Amelogenin基因座未檢測出Y等位基因,且等位基因峰高均衡,未見明顯嵌合現(xiàn)象存在。

      通過對女兒血樣,毛發(fā)常染色體STR、Y-STR及X-STR結(jié)果的分析,以上組織均有2個細胞系(46,XX/46,XY)存在,在39個常染色體STR基因座中,均能清楚的顯示其遺傳方式,其中有11個基因座出現(xiàn)三等為基因,三等位基因中有2個是來源父親的,1個是來源于母親的,且來源于母親的等位基因峰高比來源于父親的等位基因峰高兩倍,所有的39個常染色體STR基因座均只有1條母源性等位基因,沒有1個基因座顯示有2個母源性等位基因。12個X-STR基因座中,等位基因1個來源于父親,1個來源于母親,并且部分基因座峰高比接近2∶1,所有的常染色體基因座沒有出現(xiàn)四等位基因,X染色體也沒有出現(xiàn)三等位基因。

      4 分析討論

      嵌合體也被叫做奇美拉(chimera),在希臘神話中,奇美拉是獅頭,羊身,蛇尾的吐火怪物,在醫(yī)學(xué)界,它指的是人體中的遺傳物質(zhì)并非只是來自一個細胞系,可能來自于兩個或者以上的細胞系所構(gòu)成的生物體,可自發(fā)產(chǎn)生或人工產(chǎn)生。人類嵌合體是極其罕見的,一般是在血型檢測中發(fā)現(xiàn)有2種紅細胞群體或真兩性畸形來就診而被發(fā)現(xiàn)的。

      嵌合體在生物學(xué)上可以分為兩種,同源嵌合體和異源嵌合體。嵌合成分來源于同一受精卵的嵌合體稱為同源嵌合體,自發(fā)或者誘發(fā)導(dǎo)致的基因突變以及染色體畸變均可導(dǎo)致同源嵌合體的產(chǎn)生。由2個不同的受精卵融合而形成的個體為異源嵌合體,異源嵌合體[3]可分為人造異源嵌合體(artificial chimerism)、孿生子異源嵌合體(tiwn chimerism)和四配子異源嵌合體(tetragametic chimerism)。人造異源嵌合體大部分是醫(yī)源性的,是由于外周造血干細胞的輸入、異源骨髓移植或器官移植導(dǎo)致的,也可由其他原因產(chǎn)生。異卵雙生導(dǎo)致的血型嵌合是天然的奇美拉,主要是胎盤融合或者子宮內(nèi)造血干細胞的交換而導(dǎo)致的,異卵雙生的孿生子異源嵌合體細胞嵌合僅限于血細胞中,為兩種合子來源的細胞嵌合,據(jù)統(tǒng)計血型奇美拉8%來自雙胞胎,21%來至于三卵多胞胎[3]。在人類中四配子異源嵌合體是極其罕見的,常常由于兩性畸形患者就診或者ABO檢測時發(fā)現(xiàn)2種紅細胞群體而被發(fā)現(xiàn)。由于兩個合子融合并最終發(fā)育成的一個個體而導(dǎo)致的四配子異源嵌合體,這種四配子異源嵌合個體在遺傳學(xué)上含有兩種獨立的細胞系(如46,XX/46,XY細胞系),在鼠類[4-7]和其他哺乳動物[8]中均發(fā)現(xiàn)這種四配子嵌合體,在人類[9,26,28]同樣也已發(fā)現(xiàn)。 根據(jù)文獻推測有4種機制可以導(dǎo)致四配子異源嵌合體的形成[10]:(1)兩個胚胎的融合;(2)卵細胞和第一極體雙受精作用;(3)次級卵母細胞和第一極體雙受精作用;(4)卵細胞和第二極體雙受精作用。人類四配子異源嵌合體的形成機制在目前的文獻報道已發(fā)現(xiàn)了4種,第一種為兩個胚胎的融合[11-14,26];第二種為卵細胞和第二極體雙受精作用[15];第三種為卵細胞經(jīng)過孤雌分裂,形成兩個相同的配子,與兩個精子進行雙受精[16-17,23,28];第四種為產(chǎn)雄孤雌生殖[20-22]。兩個胚胎融合患者常染色體STR檢測顯示含有父源和母源各兩個不同的等位基因,也就是說四個等位基因分別來源于四個配子,隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展,體外受精[13-14]和卵胞漿內(nèi)單精子注射等技術(shù)增加了胚胎融合的風(fēng)險[18]。卵細胞和第二極體雙受精應(yīng)顯示在遠離染色體著絲粒的位點上有母源的兩個不同的等位基因[19],因為染色體要發(fā)生交換。卵細胞孤雌分裂形成兩個相同的配子雙受精,在常染色體STR檢測顯示含有兩個父源的等位基因和一個母源的等位基因,因孤雌分裂形成2個相同的配子,DNA完全相同,故顯示只有1個配子成分,也就是說只顯示一個母源的等位基因。本案例中女兒有兩個細胞群,核型為46,XX/46,XY,STR結(jié)果顯示有父源的2個不同配子成分和母源的1個配子成分,因此推斷為四配子異源嵌合體。這種情況可解釋為來自母親的生殖細胞經(jīng)孤雌分裂形成2個相同的配子與來自父親的X精子和Y精子雙受精,然后2個合子融合到1個個體,從而形成有2個細胞系的四配子異源嵌合體(見圖3)。由母親生殖細胞經(jīng)孤雌分裂形成2個相同的配子雙受精形成2個合子,經(jīng)融合后發(fā)育成的個體,這種四配子異源嵌合體案例目前報道較少見。

      圖3 四配子異源嵌合體形成機制圖解,母親的生殖細胞經(jīng)孤雌分裂形成2個相同的配子與來自父親的X精子和Y精子雙受精,然后2個合子融合到一個個體,從而形成有2個細胞系的四配子異源嵌合體

      1953年英國醫(yī)學(xué)雜志(the British Medical Journal)報道了第一例血型嵌合體 “一名女子被發(fā)現(xiàn)血液中含有兩種不同的血型”[24],1962年Gartler etal.[25]報道了第一例由于雙受精作用而導(dǎo)致的人類嵌合體,而美國母親莉迪婭事件[26]揭開了人類的嵌合體現(xiàn)象。到目前為止,報道的人類嵌合體有50余例[27],隨著醫(yī)學(xué)輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展,人類嵌合體現(xiàn)象越來越常見,目前常用的檢測嵌合體的方法主要有三種:(1)ABO 血型基因分型法;(2)HLA(人類白細胞抗原)法;(3)STR法。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,新的檢測方法也不斷在應(yīng)用,2012年,So Youn Shin等[28]首次采用SNP手段對四配子異源嵌合體進行檢測,新的檢測微嵌合體技術(shù)[29]也在不斷發(fā)展中。在親子鑒定中遇到三等為基因或者性分化異常者(存在兩個細胞系46,XX/46,XY),在染色體核型分析的基礎(chǔ)上,首先要確定是同源嵌合體還是異源嵌合體,采用常染色體STR試劑盒進行檢測,如果所有基因座都只顯示1個父源等位基因和1個母源等位基因,可判定為同源嵌合體,如果某些基因座出現(xiàn)2個母源等位基因和 (或)父源等位基因可判定為異源嵌合體。確定為異源嵌合體之后需要明確嵌合體發(fā)生的機制,首先采用常染色體靠近著絲粒STR基因座進行檢測,如果某些基因座出現(xiàn)2個母源等位基因和2個父源等位基因,說明是由于胚胎融合而形成的嵌合體,如果某些基因座出現(xiàn)1個母源等位基因和2個父源等位基因,這時候需要進一步檢測,采用常染色體末梢STR位點進行檢測,如果所有基因座出現(xiàn)1個母源等位基因,說明是由于母親生殖細胞孤雌分裂而形成的嵌合體,如果某些基因座存在2個母源等位基因,說明是由于卵子和第二極體雙受精形成的嵌合體。

      在親子鑒定實踐中,當(dāng)被檢者有2種不同性別的紅細胞群體時則容易被發(fā)現(xiàn)是嵌合體,而當(dāng)被檢者有2種細胞群性別相同或者只在血液中存在1種細胞群的時候就不容易被發(fā)現(xiàn),值得注意的是,當(dāng)嵌合體者的血液中只存在1種細胞群的時候,容易造成親權(quán)鑒定結(jié)果錯誤。在親子鑒定或個體識別中,如若遇到嵌合體現(xiàn)象,應(yīng)該引起關(guān)注,首先要排除污染因素,可通過反復(fù)實驗,更換不同試劑盒擴增來排除,若仍為嵌合體現(xiàn)象,分析其發(fā)生機制,方可作出定論,以保證鑒定結(jié)果的準確性和科學(xué)性。

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